急性鉛暴露對幼年大鼠腦海馬中PKC-γ，NOS，NO的影響.pdf

1、目的： 重金屬鉛是一種普遍存在的環(huán)境神經(jīng)毒物，具有很強的神經(jīng)親和性，可在神經(jīng)組織中蓄積，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能(主要是學(xué)習(xí)記憶功能)的長期損害。特別是對兒童學(xué)習(xí)，記憶，心理行為的影響受到人們的普遍關(guān)注。由于兒童血腦屏障發(fā)育不完整，當(dāng)血鉛水平達(dá)到100 μg/L時便能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及行為異常。因此探討鉛致神經(jīng)中毒機制非常重要。 目前鉛神經(jīng)毒作用機制研究中的一個重要內(nèi)容就是探討鉛對中樞神經(jīng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的兩個重要因素鈣和蛋白激酶

2、功能的影響。后者如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-reglJlated protein Kinase，ERK)、一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase，NOS)等。 蛋白激酶C是一種鈣活化的磷脂依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶。在調(diào)控細(xì)胞的許多生理過程，特別是在細(xì)胞內(nèi)信息傳遞途徑中，PKC起著一個關(guān)鍵的作用。目前，在鉛的神經(jīng)毒性研究過程

3、中，鉛對PKC的作用引起人們極大關(guān)注。鉛比鈣對PKC有更高的親和力?，F(xiàn)己知，Pb<'2+>可以取代Ca<'2+>激活蛋白激酶在學(xué)習(xí)記憶中的正常功能和PKC γ同工酶的分布。從而干擾LTP(長時程增強)的形成和維持。但做為腦組織中所獨有的蛋白激酶C的一個亞型，PKC-γ在小鼠腦組織中的表達(dá)變化情況尚未清楚，有進(jìn)一步進(jìn)行研究的可行性。本研究通過對急性染鉛小鼠腦海馬中PKC—Y的異常表達(dá)探討鉛的神經(jīng)毒理作用機制。 一氧化氮(nitri

4、c oxide，NO)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間的信息分子，在腦海馬內(nèi)主要影響學(xué)習(xí)記憶功能。一氧化氮合酶(NOS synthase，NOS)是催化合成內(nèi)源性NO的唯一酶類，在很大程度上決定著NO的生物學(xué)效應(yīng)。NOS是鉛毒作用的靶分子之一，本研究通過NOS活性和NO含量測定，進(jìn)一步探討急性染鉛對它們的影響機制。本研究從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)角度較全面地探討鉛對學(xué)習(xí)記憶影響的生化機制。證明急性鉛中毒可干擾PKC-γ的表達(dá)，擾亂NOS活性和降低NO含量，使

5、小鼠空間學(xué)習(xí)記憶及被動回避反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶能力下降。為揭示鉛中毒機制提出了新觀點。 方法: 1．大鼠急性鉛暴露腦片的制作出生30d健康大鼠，頸部脫臼法處死，迅速取出海馬，放入預(yù)冷的人工腦脊液(ACSF，mmol·L<'-1>NaCl 124，KCl 4．4，CaCl<,2> 2．5，MgSO<,4> 1．3，NaH<,2>PO<,4>l，NaHCO<,3>26，葡萄糖10)中。將海馬橫切為350 μm腦片放到6孔培養(yǎng)板中，分

6、為對照組和染鉛組。用預(yù)先通以95％O<,2>+5％CO<,2>的混合氣體的ACSF灌流，流速1 mL·min<'-1>，溫度32.5～33.5℃。穩(wěn)定2 h后，染鉛組改用含20 μmol·L<'-1>醋酸鉛的ACSF灌流。醋酸鉛加入培養(yǎng)板時間計時為0 min．。分別于0，3，7．5，15，30，60，120 min．收集腦片，即為急性染鉛大鼠海馬腦片樣品，對照組始終以ACSF灌流并與急性染鉛組同一時間收集腦片。將培養(yǎng)的大鼠海馬腦片放到0

7、.5 g·L<'-1>MTT中室溫觀察15 min．，如顏色由白變黑則證明存活。在所有腦片收集完成后剩余的腦片仍然存活則保留所收集的樣品，否則棄之。在10倍于其體積的裂解緩沖液中迅速攪成勻漿。將樣品以12000g離心1hr。吸出上清液，棄去沉淀，加入樣品緩沖液，將制備好的樣品置于-70℃冰箱備用。 2．測定指標(biāo)及方法2．1利用PKC-γ抗體，Western blot方法測定急性染鉛小鼠海馬中PKC-γ異常表達(dá)(標(biāo)本處理，提取蛋白

8、質(zhì)，蛋白定量，電泳，電轉(zhuǎn)移，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色)。 2．2利用NO和NOS試劑盒測定NO含量和NOS活性(原理是采用檢測NO的中間代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽來反映NO。離心后取上清液再加入檢測試劑，酶標(biāo)儀測吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算亞硝酸鹽的含量，換算出NO含量。采用放射強度測定法測定NOS活性)。 3．統(tǒng)計分析處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計包進(jìn)行獨立樣本t檢驗。 結(jié)果:

9、 1．急性鉛暴露對小鼠海馬組織中PKC-γ蛋白表達(dá)的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后PKC-γ表達(dá)基本保持不變，同濃度醋酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過相應(yīng)不同時間的染鉛海馬中PKC-γ表達(dá)與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中PKC-γ表達(dá)在30和60min時分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 2．急性鉛暴露對小鼠海馬中一氧化氮合酶活性的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后一氧化氮合酶活性基本保持不變，同濃度醋

10、酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過相應(yīng)不同時間的染鉛海馬中一氧化氮合酶活性與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中一氧化氮合酶活性在30和60min時分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 3．急性鉛暴露對小鼠海馬中一氧化氮的影響正常組小鼠海馬在培養(yǎng)液培養(yǎng)前后一氧化氮含量基本保持不變，同濃度醋酸鉛暴露的小鼠經(jīng)過相應(yīng)不同時間的染鉛海馬中一氧化氮含量與正常組相比有不同程度的變化。染鉛組小鼠海馬中一氧化氮含量在30和60min時分別

11、有所下降，120min后恢復(fù)到接近正常水平。 結(jié)論: 1．與正常組相比不同時間的鉛暴露可引起PKC-γ的異常表達(dá)；在30和60min時分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 2．與正常組相比不同時間的鉛暴露可對一氧化氮合酶活性，一氧化氮含量有明顯的影響；在30和60min時分別有所下降，120 min后恢復(fù)到接近正常水平。 3．第一部分與第二部分得到的結(jié)果反映出，鉛對小鼠腦細(xì)胞中的PKC-γ的