芬戈莫德對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)及體外神經(jīng)干細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目的：
　　通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察FTY720對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)作用和血-脊髓屏障功能的影響，探討相關(guān)的作用機(jī)制；同時(shí)初步觀察FTY720-P對(duì)體外NSCs增殖、遷移和分化的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床脊髓損傷治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。
　　方法：
　　1.制備SD大鼠脊髓半橫切損傷模型并隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組（NG組）、假手術(shù)組（SO組）、損傷對(duì)照組（HS組）、芬戈莫德治療組（FTY720組）。分別于損傷后1天

2、、3天、7天、14天、28天對(duì)各組大鼠進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、水平網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)觀察損傷側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)和放置功能；神經(jīng)誘發(fā)電位實(shí)驗(yàn)觀察損傷側(cè)神經(jīng)束傳導(dǎo)功能；HE染色觀察損傷周圍組織病理形態(tài)變化以系統(tǒng)評(píng)價(jià) FTY720對(duì)神經(jīng)功能修復(fù)作用的影響；最后通過伊文思藍(lán)滲透性實(shí)驗(yàn)觀察FTY720對(duì)大鼠脊髓損傷后血-脊髓屏障功能的影響，探討其可能的作用機(jī)制。
　　2.采用孕14.5-16.5天的SD大鼠胎鼠進(jìn)行NSCs的體外分離培養(yǎng)，并利用細(xì)胞免疫熒光化

3、學(xué)染色法對(duì)NSCs相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定；觀察體外培養(yǎng)的NSCs在不同濃度的磷酸化形式FTY720-P（0nM、1nM、10nM、100nM）作用下其增殖率、遷移能力及分化方向的改變。結(jié)果1.半橫切損傷后，HS組和FTY720組大鼠損傷側(cè)脊髓神經(jīng)功能下降，至28天時(shí)仍未恢復(fù)至NG組和SO組水平。行為學(xué)檢測(cè)和神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果提示，F(xiàn)TY720組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)速度比HS組更快；損傷7、14、28天時(shí)，兩組大鼠BBB評(píng)分和SEP P1波潛

4、伏期檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；損傷14、28天時(shí)，兩組大鼠水平網(wǎng)格檢測(cè)和 MEP N1波潛伏期檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)NG組和SO組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)均完整；損傷14天時(shí)，F(xiàn)TY720組脊髓損傷處慢性炎癥細(xì)胞浸潤，膠質(zhì)化反應(yīng)程度小于HS組；損傷28天時(shí)，F(xiàn)TY720組損傷處空洞殘存面積小于HS組，再生纖維排列較HS組有序。
　　2.血-脊髓屏障滲透性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷后7天內(nèi)，HS組

5、和FTY720組大鼠血-脊髓屏障EB滲出量較NG組和SO組明顯增加；各時(shí)間點(diǎn)FTY720組EB滲出面積均小于HS組(P<0.05)，其中損傷3天時(shí)差異最為顯著。
　　3．體外NSCs成功提取、分離培養(yǎng)并鑒定。
　　4．在未添加bFGF的培養(yǎng)基中，不同濃度FTY720-P處理后的各組NSCs增殖率較對(duì)照組差異不明顯。在添加有bFGF的培養(yǎng)基中， NSCs增殖率明顯增加，其中10nM、100nM組細(xì)胞增殖率增加顯著，與對(duì)照組比較

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　5．利用細(xì)胞免疫熒光染色對(duì)體外誘導(dǎo)分化的NSCs行β-tublinIII和GFAP雙標(biāo)鑒定發(fā)現(xiàn)，1nM、10nM、100nM濃度的FTY720-P對(duì)β-tublinIII表達(dá)陽性的神經(jīng)元和GFAP表達(dá)陽性的星型膠質(zhì)細(xì)胞分化比例沒有顯著的影響。但在分化出的星型膠質(zhì)細(xì)胞中，隨著FTY720-P濃度的增加，原漿型星型膠質(zhì)細(xì)胞的比例上升。
　　6．利用細(xì)胞小室遷移和結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)觀察FTY720-

7、P對(duì)NSCs遷移能力的影響發(fā)現(xiàn)，隨FTY720-P濃度增加，NSCs遷移數(shù)量增加，10nM、100nM組NSCs遷移數(shù)量增加明顯，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　FTY720能顯著減少脊髓損傷后急性期血-脊髓屏障滲透性，有效促進(jìn)急性期后神經(jīng)功能的恢復(fù)；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)FTY720-P在一定劑量下能與bFGF協(xié)同作用，促進(jìn)NSCs增殖；對(duì)NSCs產(chǎn)生化學(xué)趨化作用，促進(jìn)NSCs的遷移；同時(shí)，F(xiàn)TY720-P還