基于遺傳圖譜和生物信息學的抗旱新基因發(fā)掘.pdf

1、本文利用模式植物已有的大量核酸資源與生物信息資源、技術(shù)與方法，對水稻抗旱QTL區(qū)間內(nèi)進行in silico分析，發(fā)掘目標區(qū)間內(nèi)的有用信息，通過半定量PCR技術(shù)對取得的核酸序列進行分析，篩選目標區(qū)間內(nèi)的抗旱候選基因。 根據(jù)本試驗室已有的水稻抗旱QTL定位結(jié)果及已發(fā)表的抗旱定位結(jié)果，選擇水稻第4染色體的RM241-RM349標記區(qū)間為本研究目標區(qū)間，該區(qū)間包含了與根系、葉片水分狀況及產(chǎn)量相關的抗旱QTL。利用PlantQTL-GE取

2、得了206個位于目標區(qū)間內(nèi)的抗旱相關EST。其中非冗余EST167條。通過PCR擴增、克隆測序列獲得了128條EST。 在苗期干旱處理30min，3h，8h和20h，生長后期中旱和重旱處理的根、葉和穗樣品中，對128條EST進行半定量分析，獲得了這些EST在不同發(fā)育時期、不同植株部位及不同干旱脅迫程度下的表達譜。分析結(jié)果表明： 1．苗期和生長后期旱處理的根、葉和穗中上升表達的EST多于下降表達的EST。目標區(qū)間內(nèi)的128

3、條EST在根中產(chǎn)生干旱響應變化的EST多于葉和穗，表明此區(qū)間內(nèi)大量EST可能與根感受土壤干旱信號有關。 2．發(fā)現(xiàn)一些在不同的生長發(fā)育時期、不同的處理條件及不同部位均表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)的EST，及在同一部位不同發(fā)育時期，同一發(fā)育時期不同部位或不同部位不同發(fā)育時期表現(xiàn)相反的EST。前者主要參與電子傳遞、氨基酸代謝和蛋白質(zhì)水解，與信號傳遞、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的形成有關。后者則主要參與蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)生物合成，涉及信號傳遞與干旱應激蛋白的形

4、成。 3．GO分析結(jié)果表明在干旱脅迫早期(苗期)及中旱(生長后期)條件下，上升與下降表達所涉及的EST個數(shù)及其對應的GO類型都明顯多于脅迫后期(苗期)與重旱(生長后期)條件下涉及的ES2、個數(shù)與GO類型。且產(chǎn)生干旱響應的：EST可集中歸于少數(shù)幾類GO，這些EST可能具有的特定的功能對植株抗旱、耐早產(chǎn)生重要作用。 4．KOBAS分析結(jié)果表明只有24個基因可對應到代謝通路中。共涉及53種代謝途徑，主要包括CO2固定、糖代謝、

5、氮代謝、次生物質(zhì)代謝及信使分子代謝等。糖代謝和氮代謝與水分脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累有關。信使分子代謝涉及鞘脂類信使鞘氨醇-1-磷酸和肌醇磷脂信使3磷酸肌醇。由于定位到通路上的基因很少，且每種通路基本只對應了一個基因，因此難以通過代謝通路來深入闡明目的區(qū)間內(nèi)抗旱基因與性狀的關系及抗旱基因間的關系，需要進一步的實驗分析。 5．通過表達譜分析并參考前人的研究報道，選擇了12個候選基因，其中2是轉(zhuǎn)錄因子(GATA、GRAS)5個為有預測

6、功能的基因(鞘氨醇激酶、蛋白激酶、鈣依賴蛋白激酶、E3連接酶、蛋白磷酸酶2C)，5個是無預測功能的基因，但其包含的結(jié)構(gòu)域(RPR、RRM、HDAC interact、FBOX/WD40)可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及蛋白降解有關。 克隆了鞘氨醇激酶基因(OsSphKd)和E3連接酶基因(OsRJNGzfl)。鞘氨醇激酶基因密碼子序列長2247bp。序列比對分析表明其與擬南芥的AtLCBK相似性達70％，具有該基因家族保守的催化活性位點區(qū)，在氨

7、基酸序列上與動物的SphK2基因更相似。E3連接酶基因密碼子序列長564bp，其編碼蛋白N端含3個TM區(qū)，C端有一個RING-H2結(jié)構(gòu)，該基因與擬南芥中兩個預測為RING-H2型的E3連接酶相似性達83％和84％。 在干旱、ABA、SA、JA、NaCl、Marmitol和H<,2>O<,2>處理下對OsSphKd和OsRINGzfl進行了熒光定量分析，結(jié)果表明鞘氨醇激酶基因在葉中的表達發(fā)生了顯著的變化，而在根中則變化不大，因此認

8、為OsSphKd基因產(chǎn)生的干旱響應是葉特異的，該基因可能參與了多種逆境響應。E3連接酶基因在葉和根中的表達都發(fā)生了變化，在葉中主要為上調(diào)表達，但其在根中的變化較多樣，因此認為OsRINGzfl可能存在較復雜的逆境響應方式，或是處于逆境響應的較下游。 根據(jù)上述結(jié)果，可分別設計下一步的實驗對OsSphKd和OsRINGzfl基因進行功能驗證，證實OsSphKd基因?qū)λ救~片氣孔的調(diào)節(jié)作用，及該基因是如何感受干旱條件下的ABA信號，即