第一部分 應(yīng)用生物發(fā)光顯像技術(shù)研究血管生成抑制因子vasostatin的抗腫瘤生成作用;第二部分 hSelK的功能及硒代半胱氨酸的參入機(jī)制研究.pdf

1、很多研究表明實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移都與血管生成密切相關(guān)。利用血管生成抑制劑進(jìn)行的腫瘤抗血管生成治療為實(shí)體瘤的治療提供了新的策略。一些血管生成抑制劑如endostatin、angiostatin、TNP-470等已被發(fā)現(xiàn)并被應(yīng)用于研究腫瘤的治療。Vasostatin是1998年P(guān)ike等從Epstein-Barrvirus免疫細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液中分離純化的一種血管生成抑制因子，經(jīng)鑒定證實(shí)為多功能蛋白質(zhì)calreticulin的N端結(jié)構(gòu)

2、域片段。Vasostatin在體外可抑制內(nèi)皮細(xì)胞如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖；在裸鼠腫瘤形成試驗(yàn)中，vasostatin可明顯減低人Burkitt淋巴瘤、人結(jié)腸癌和胰腺癌的生長，延長帶MethA和LL/2c腫瘤小鼠的存活時(shí)間。 近些年來，基因治療特別是腫瘤基因治療發(fā)展很快。在對(duì)轉(zhuǎn)染基因的定位和表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測時(shí)，基因顯像是最有效的方法。一些非侵入性的活體成像技術(shù)，如PET、SPECT、MRI、超聲、CT、生物發(fā)光顯像和熒光

3、顯像可用于活體動(dòng)物進(jìn)行基因表達(dá)顯像。其中，生物發(fā)光顯像(Bioluminescenceimaging，BLI)是利用螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase，F(xiàn)Luc)，在ATP、氧氣的輔助下，與外源注入的特異底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光，使用高度靈敏的CCD相機(jī)可觀測并紀(jì)錄發(fā)出的光子，進(jìn)行顯像。 將報(bào)告基因與所感興趣的治療基因偶聯(lián)，通過對(duì)報(bào)告基因顯像可以間接監(jiān)測治療基因的表達(dá)。本研究采用融合表達(dá)方案，將治療基因(vasostat

4、in)和報(bào)告基因(fluc)偶聯(lián)構(gòu)建融合表達(dá)載體，通過生物發(fā)光顯像技術(shù)對(duì)報(bào)告基因fluc顯像來監(jiān)測治療基因vasostatin的抗腫瘤生成作用。為使表達(dá)的融合蛋白中兩個(gè)蛋白互相不干擾，并有天然的特性，我們在治療基因vasostatin和報(bào)告基因fluc之間加入了四種不同長度的柔性短肽，其氨基酸序列為(GGGGS)n。然后在293ET和PC3細(xì)胞中驗(yàn)證了四種融合重組質(zhì)粒的熒光素酶活性。其中，含柔性肽段(GGGGS)2的融合表達(dá)重組質(zhì)粒(v

5、10fl)熒光素酶活性最佳。 篩選穩(wěn)定表達(dá)V10FL融合蛋白和陽性對(duì)照Fluc的PC3細(xì)胞后，用生物發(fā)光顯像技術(shù)進(jìn)行了體外顯像。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照FLuc能檢測到的最少細(xì)胞數(shù)為300～700/孔，而V10FL融合蛋白為1500～3000/孔。兩種穩(wěn)定細(xì)胞系中，每孔發(fā)出的光子數(shù)與細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性均很好(r2分別為0.98和0.97)。用穩(wěn)定表達(dá)Fluc的PC3細(xì)胞構(gòu)建荷瘤模型，用生物發(fā)光顯像能檢測到腫瘤的發(fā)生，隨著瘤體的增大，生物發(fā)

6、光信號(hào)也逐漸增強(qiáng)。 隨后，用前列腺癌細(xì)胞系PC3和血管內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC研究了vasostatin的體外活性。用腺病毒載體攜帶治療基因vasostatin，感染PC3細(xì)胞后，通過RT-PCR能夠檢測vasostatinmRNA表達(dá)的增加，Westernblot分析也能在培養(yǎng)上清液中檢測到vasostatin蛋白的分泌。用Ad-vasostatin感染HUVEC和PC3細(xì)胞，Ad-vasostatin能夠明顯抑制HUVEC的增殖

7、，而對(duì)PC3沒有明顯影響。 硒是哺乳動(dòng)物必需的一種微量營養(yǎng)元素，其生物學(xué)功能主要以硒蛋白的形式表現(xiàn)。硒蛋白的特征是蛋白中含有硒代半胱氨酸(Sec)，硒代半胱氨酸為第21種氨基酸，由通常情況下作為終止密碼子的UGA編碼。真核生物硒蛋白的生物合成過程中，硒代半胱氨酸的參入需要3’非編碼區(qū)(3'UTR)的硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)，SECIS結(jié)合蛋白SBP2等。目前為止，共鑒定出約25種人硒蛋白基因。人硒蛋白K(hSelK)是

8、新發(fā)現(xiàn)的一種編碼硒蛋白的基因，目前它的生物學(xué)功能和硒代半胱氨酸的參入機(jī)制尚不清楚。用同位素參入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hSelK硒代半胱氨酸的參入需要hSelKmRNA的3'UTR。然后，利用RNA凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)和SECIS元件突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SBP2能和hSelK3'UTR的SECIS元件相互作用，SBP2能特異性結(jié)合hSelKSECIS元件的非Watson-CrickG-A/A-G四聯(lián)體堿基對(duì)。為了探尋hSelK的功能信息，用Northern雜交