前列腺素D合成酶在男性生殖中的基礎及應用研究.pdf

1、Lipocalin型前列腺素D合成酶(Lipocalin-typeProstagladinDSynthase，L-PGDS)亦稱β-traceprotein，是機體組織屏障的主要成分，屬Lipocalin家族。Lipocalins為一組分子量較小的分泌性蛋白質(zhì)，它們的共同特性是可結合和運輸親脂/疏水分子，L-PGDS為此家族中唯一有酶活性的蛋白質(zhì)。L-PGDS主要分布于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和雄性生殖器官，并分泌至腦脊液、血清、精液、尿

2、液、羊水等體液中。L-PGDS是一種雙功能蛋白，除催化PGD2產(chǎn)生外，亦可結合和運輸親脂/疏水分子。該蛋白具有廣泛的生理學作用，它不僅與睡眠誘導、體溫調(diào)節(jié)、感受傷害、氣味應答有關，亦是一種生育相關蛋白，可能參與精子的發(fā)生和成熟。研究顯示，對于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、心血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病等，L-PGDS已成為一個有用的輔助診斷指標。 雖然L-PGDS的性質(zhì)、結構已經(jīng)基本研究清楚，但是它在雄性生殖系統(tǒng)中的組織分布和細胞內(nèi)的定

3、位、在雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)的具體功能、代謝過程、作用機制以及與相關疾病的具體關系僅限于假設性的推測，尚缺乏有力的實驗來確證。本研究的焦點集中在L-PGDS在男性生殖中的基礎研究以及在體內(nèi)的生理作用功能和病理作用機制的初步探討等方面。 實驗研究以本研究室構建的重組表達質(zhì)粒pPIC9/htL-PGDS為基礎，BglⅡ?qū)⒅亟M質(zhì)粒pPIC9/htL-PGDS線性化后，電穿孔法將其導入巴斯德畢赤氏酵母GS115。菌落PCR對酵母轉(zhuǎn)化菌進行鑒定后

4、，甲醇誘導重組蛋白的表達，結果得到一株L-PGDS表達陽性克隆，Mr約為27000，與理論值完全一致。培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE電泳后，進行薄層掃描分析，Mr為27000的L-PGDS的含量約占酵母培養(yǎng)上清中總蛋白含量的18％。Bradford法測定培養(yǎng)上清的總蛋白含量約為150mg/L，因此，重組L-PGDS的表達量可達27mg/L左右。再通過鎳離子金屬親和層柱對重組L-PGDS進行了純化，并用糖苷酶F對其進行了消化。結果表明，通過P

5、ichiaPastoris系統(tǒng)表達的重組蛋白除Mr為27000的主帶外，尚存在Mr為24000、21000的兩條弱帶，這兩條弱帶為糖基化不完全所致。純化蛋白與視黃酸結合后，其紫外吸收波譜發(fā)生紅移，證實重組L-PGDS具有生物學活性。Westernblotting分析亦表明重組L-PGDS可與兔抗人L-PGDS多克隆抗體發(fā)生特異結合。 用雜交瘤技術，將骨髓瘤細胞SP2/0與分泌L-PGDS抗體的小鼠脾細胞融合成雜交瘤細胞，利用瘤細

6、胞無限增殖及免疫細胞分泌抗體的能力大量制備針對L-PGDS抗原的McAb。首先以重組L-PGDS作為抗原免疫BALB/c小鼠，免疫成功后取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過陽性克隆有限稀釋法，得到一株IgG1類L-PGDSMcAb；再將生長良好的雜交瘤細胞接種到石蠟油預處理的BALB/c小鼠腹腔中，制備腹水型抗人L-PGDSMcAb。ELISA與Westernblot分析鑒定其特異性。結果獲得了1株抗人L-PGDS的單克隆抗

7、體，其效價為1：1000，抗體親和力為2×108L/mol，小鼠IgG亞型為IgG1，Westernblot結果顯示該抗體能特異性識別L-PGDS。 采用RT-PCR技術，以一組前導序列的簡并引物，從1株穩(wěn)定分泌抗人L-PGDS單抗的鼠雜交瘤細胞中擴增出抗體的輕鏈可變區(qū)基因2個、重鏈可變區(qū)基因1個；然后分別克隆至pGEM-T載體，并測序。測序結果表明，其中1個Vκ為鼠骨髓瘤細胞系中固有的無功能基因；另一Vκ和VH經(jīng)KabatIg

8、比對分析，與其同源性較高的序列均為鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因，且堿基序列符合鼠抗體可變區(qū)特征。利用一柔性連接短肽[(Gly)4Ser]3，SOEPCR法將上述重、輕鏈可變區(qū)拼接成完整的抗人L-PGDS單鏈抗體基因，并裝入表達載體pET-28a(+)，在BL21宿主菌中進行表達。經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示，在低劑量0.02mMIPTG誘導和在較低溫度25℃或28℃下培養(yǎng)，重組菌表達了一定量的可溶性單鏈抗體。后經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，得率

9、為2mg/100ml，純度達92％；雙夾心ELISA和免疫熒光競爭抑制實驗證實，純化后的抗人L-PGDS單鏈抗體具有較好的親和力和特異性。 運用RT-PCR、WesternBlot技術探討分析L-PGDS在人睪丸與附睪頭、附睪體和附睪尾中的表達及其差異。運用免疫組織化學技術探討分析L-PGDS在睪丸與附睪頭、附睪體和附睪尾中的分布。用免疫細胞化學技術探討分析L-PGDS在精子表面的分布，并用流式細胞術探討各類不育病人精子表面L-

10、PGDS的表達差異。RT-PCR和WesternBlot研究發(fā)現(xiàn)，L-PGDS在睪丸中有表達，在附睪中有較強表達，附睪頭表達量最高，附睪體次之，附睪尾最低。免疫組織化學結果顯示，免疫陽性產(chǎn)物L-PGDS在睪丸支持細胞、間質(zhì)細胞、生精細胞以及精子表面都有表達，且主要分布于皮細胞的胞質(zhì)、纖毛以及精子的表面。流式細胞分析結果顯示正常人精子表面的L-PGDS的熒光強度為244.829±77.174，不育癥患者精子表面L-PGDS熒光強度為59.

11、471±62.685。從正常組到不育組，精子表面L-PGDS熒光強度顯著降低，差異極其顯著(P＜0.01fort-test)。并且精子表面的L-PGDS與精子密度成正相關(Spearman'sr=0.759，P＜0.01)。 建立了一種檢測精漿內(nèi)L-PGDS的雙抗體夾心ELISA，并用于臨床標本的檢測。確定包被小鼠抗人L-PGDS單克隆抗體和兔抗人L-PGDS多克隆抗體的最佳工作濃度，建立雙抗體夾心ELISA，并對方法進行鑒定。

12、再以建立的方法檢測臨床標本。建立的雙抗體夾心ELISA，其檢測下限為0.016μg/L，回收率為93％～115％，批內(nèi)CV范圍為2.2％～6.1％，批間CV范圍為7.8％～8.2％，線性范圍為0.020～200μg/L。 分析了L-PGDS與精子密度、精子活力、酸性磷酸酶以及α-葡萄糖苷酶之間的相關性，用WLJY-9000偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測定精子密度以及活力，用雙抗體夾心ELISA法檢測L-PGDS，用葡萄糖酶法測定α-

13、葡萄糖苷酶，用間苯二酚法測定精漿果糖，WTO推薦方法檢測精漿酸性磷酸酶。實驗結果以均數(shù)±標準差表示，以x2檢驗、ANOVA分析方法進行統(tǒng)計學處理。用SPSS11.0分析系統(tǒng)完成處理過程。所有被研究的參數(shù)中，只有L-PGDS的濃度在3個臨床組間差異顯著。經(jīng)ANOVA分析，正常對照組(10.242±4.903)、寡精子組(1.703±1.403)以及無精子組(1.196±0.964)患者精漿內(nèi)L-PGDS濃度差異顯著，并且，從正常組到寡精子

14、組以及無精子組患者精漿內(nèi)L-PGDS濃度依次降低。不同參數(shù)間的相關性用Spearman's相關系數(shù)表示，L-PGDS與精子密度、精子活力以及α-葡萄糖苷酶正相關，其相關系數(shù)分別為0.813、0.380和0.426。其他參數(shù)間沒有相關性。 總之，我們用真核表達的方法從畢赤氏酵母中成功表達出了大量的具有生物學活性的人L-PGDS；并以之為抗原，制備出了親和力強特異性高的小鼠抗人L-PGDS單克隆抗體以及單鏈抗體；用該抗體作為研究工具