強直性脊柱炎的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、強直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是常見的炎癥性系統(tǒng)性風(fēng)濕病，其發(fā)病率及致殘率均較高，但至今其病因及發(fā)病機制研究尚未完全闡明，早期診斷尚存在較大困難，目前亦無理想的根治方法。因此，對AS的病因、發(fā)病機制、診斷指標(biāo)、治療靶點和治療相關(guān)藥物的進一步研究，以加強對AS疾病的了解和認識，使AS患者在疾病早期能得到正確的診斷和有效治療，對于改善AS患者預(yù)后、提高國民健康素質(zhì)均有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有高通量、高

2、靈敏度和高精確度等優(yōu)點，有關(guān)AS患者蛋白質(zhì)組差異表達情況至今尚罕有報道，本研究擬探討AS患者蛋白質(zhì)組差異表達情況，為以后AS的發(fā)病機制、早期診斷和治療提供理論依據(jù)和重要的研究線索。
　　 第一部分
　　 強直性脊柱炎患者外周血單個核細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的:
　　 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)尋找并鑒定AS患者、RA患者與健康志愿者(Healthy Volunteer，HV)之間外周血單個

3、核細胞(PBMCs)的差異表達蛋白，再挑選部分在AS中有顯著差異表達的蛋白采用Western-blot和/或?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法擴大樣本量進行驗證，尋找AS的疾病相關(guān)蛋白，為AS的發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷以及治療提供新的理論依據(jù)和研究線索。
　　 材料與方法:
　　 1.分別收集年齡與性別相互匹配的AS患者、HV和RA患者EDTA抗凝血各6例。分離PBMCs并提取總蛋白后分別進行雙向凝膠電泳。凝膠圖譜經(jīng)PDQue

4、st軟件分析后找出組間表達差異至少達5倍的蛋白質(zhì)點行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)或MALDI-TOF-TOF-MS分析獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)或肽序列標(biāo)簽(PST)，然后利用Mascot搜索引擎搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。
　　 2.將研究樣本擴大到每組32例，從鑒定出的在AS患者有顯著差異表達的蛋白中挑選Talin1和Integrin-Iinked kinase以Western

5、-blot方法進行驗證，并進一步采用實時熒光定量RT-PCR對Talin1 mRNA進行檢測，以驗證雙向電泳發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)表達結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立了重復(fù)性好、分辨率高的PBMCs蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳圖譜。軟件分析后得到10個在AS組中高表達的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定出6個蛋白，分別為丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase，PK)、肌動蛋白抑制蛋白1(Profilin1，PFN1)、踝蛋白

6、1(Talin1，TLNl)、親環(huán)素A(Cyclophilin A，CYPA)A鏈、未知蛋白(gi|16306948)和整合素連接激酶(Integrin-IinkedKinase，ILK)。
　　 2.Western-blot結(jié)果提示，經(jīng)內(nèi)參校正后的TLN1在AS、HV及RA組分別為1.1411±0.4292、0.4686±0.2139和0.3805±0.1590，而ILK則分別為1.1201±0.2705、0.7404±0.2

7、310和0.7011±0.3794，TLN1及ILK在AS組的平均表達水平均明顯高于HV和RA組(P<0.05)； RA組患者TLN及ILK的平均表達水平較HV組稍低，但兩組間的差異并無顯著性(P>0.05)。
　　 3.實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，AS、HV及RA組TLN1 mRNA的水平分別為9.36±2.20、1.00±0.24和0.97±0.20，AS組明顯高于HV及RA組(P<0.05)，而RA組患者TLN1 m

8、RNA水平與HV組相近(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可成功建立PBMCs差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，為尋找疾病相關(guān)蛋白質(zhì)和疾病標(biāo)志物的研究提供了有效手段。
　　 2.AS患者、健康志愿者和RA患者PBMCs蛋白表達譜間存在差異，PK、PFN1、TLN1、CYPAA鏈、ILK在AS患者中存在明顯而特異的表達增高。
　　 3.PK、PFN1、TLN1、CYPA A鏈及ILK可

9、能為AS的疾病相關(guān)蛋白，可作為AS潛在的疾病標(biāo)志物行進一步研究，為AS的發(fā)病機制和血液學(xué)診斷指標(biāo)的研究提供了重要線索。
　　 第二部分
　　 強直性脊柱炎患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的:
　　 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)尋找并鑒定AS患者、RA患者與健康志愿者(Healthy Volunteer，HV)血清之間的差異表達蛋白，并挑選部分差異蛋白采用ELISA方法擴大樣本量進行驗證，尋找AS患

10、者血清中的疾病相關(guān)蛋白，為AS的發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷以及治療提供新的理論依據(jù)和研究線索。
　　 材料與方法:
　　 1.分別收集年齡與性別相互匹配的AS患者、HV和RA患者血清各6例。采用混合上樣方法，經(jīng)去除高峰度蛋白后分別進行雙向凝膠電泳。凝膠圖譜經(jīng)PDQuest軟件分析后找出組間表達差異至少達5倍的蛋白質(zhì)點行MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS分析獲得PMF或PST，然后利用Mascot搜索

11、引擎搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。
　　 2.將研究樣本擴大到每組32例，從鑒定的差異蛋白中挑選CP protein和transthyretin經(jīng)ELISA進行檢測，以驗證雙向電泳發(fā)現(xiàn)的差異蛋白表達結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立了重復(fù)性好、分辨率高的血清蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳圖譜。軟件分析后得到13個在AS和/或RA組中存在異常表達的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出10個蛋白，其中plasma

12、glutathione peroxidase(GPx3)和similar tocomplement component3僅在AS組中表達降低，transthyretin(TTR)A鏈在AS及RA組表達均明顯下調(diào)，amyloid related serum protein SAA(SAA)、apolipoprotein A(ApoA)-IV、ApoA-IV precursor、haptoglobin Hp2(Hp2)、CP protein

13、和IGSF22 protein在AS及RA組表達均升高，而HT016僅在RA組表達增高。
　　 2.經(jīng)ELISA檢測，CP在AS、HV及RA組分別為0.2963±0.0650、0.2035±0.0374和0.3295±0.1125 mg/ml，AS及RA組較HV組明顯升高(P<0.05)，而AS與RA組間差異無顯著性(P>0.05)；TTR在AS、HV及RA組分別為0.0993±0.0197、0.1544±0.0431和0.10

14、77±0.0219 mg/ml，AS與RA組較HV組有明顯降低(P<0.05)，而AS與RA組間差異無顯著性(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)有效去除高豐度蛋白后，利用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可成功建立血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，為尋找疾病相關(guān)蛋白和疾病標(biāo)志物的研究提供了有效手段。
　　 2.AS患者、健康志愿者和RA患者血清蛋白表達譜間存在差異，GPx3和similar tocomplement c

15、omponent3在AS患者中存在特異的表達降低，而HT016僅在RA組高表達，因而這3個蛋白有可能為AS或RA潛在的血清疾病標(biāo)志物，經(jīng)進一步驗證后作為AS和RA早期診斷和鑒別診斷指標(biāo)，也有可能作為AS或RA特異性藥物治療的研究靶點。
　　 3.TTR在AS與RA患者中表達均下降而SAA、ApoA-IV、ApoA-IV precursor、Hp2、CP protein及IGSF22 protein在AS與RA患者中表達均升高，這