過(guò)度活躍膀胱中不穩(wěn)定收縮機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：過(guò)度活躍膀胱中不穩(wěn)定收縮的神經(jīng)肌電研究 背景和目的： OAB患者尿急的感覺(jué)首先考慮有來(lái)自膀胱經(jīng)盆神經(jīng)向中樞的傳入信號(hào)；再次不穩(wěn)定收縮時(shí)，膀胱壓力的期相性升高可能和支配膀胱的副交感神經(jīng)(亦走行在盆神經(jīng)內(nèi))的傳出信號(hào)有關(guān)。即便有證據(jù)說(shuō)明這種不穩(wěn)定收縮的起源系由膀胱局部因素引發(fā)產(chǎn)生，甚至并不依賴于盆神經(jīng)傳遞信號(hào)，但在其不穩(wěn)定收縮時(shí)膀胱的感覺(jué)傳入神經(jīng)也可能會(huì)將壓力上升的感覺(jué)信號(hào)傳入中樞，而這

2、恰恰可能和OAB患者的尿急癥狀密切相關(guān)。 另一方面，從膀胱感覺(jué)角度(傳入神經(jīng)纖維)考察，如果在不穩(wěn)定收縮時(shí)記錄到膀胱感覺(jué)神經(jīng)的傳入信號(hào)隨膀胱壓力增強(qiáng)，則可說(shuō)明不穩(wěn)定收縮時(shí)有傳入信號(hào)進(jìn)入中樞，并且這可能是病人引發(fā)尿急癥狀的原因，從而說(shuō)明膀胱不穩(wěn)定收縮是有其存在的神經(jīng)因素，并且此傳入信號(hào)和臨床尿急癥狀密切。 材料和方法： 1.建立BOO大鼠，梗阻方法包括經(jīng)恥骨上膀胱頸梗阻、經(jīng)會(huì)陰尿道梗阻、和經(jīng)閉孔恥骨后中段尿道梗阻。

3、 2.充盈性膀胱測(cè)壓檢查確定BOO大鼠6-8周后是否存在充盈期不穩(wěn)定收縮，按ICS的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)大于15cmH2O的不穩(wěn)定收縮確定OAB大鼠。 3.烏拉坦麻醉OAB大鼠，分別在膀胱充盈測(cè)壓(模式A)和膀胱頸結(jié)扎等容(0.8ml;模式B)下，進(jìn)行顯微手術(shù)暴露盆神經(jīng)、陰部神經(jīng)運(yùn)動(dòng)支、尿道外括約肌等盆會(huì)陰結(jié)構(gòu)，進(jìn)行同步化神經(jīng)、肌電生理記錄，測(cè)定不穩(wěn)定收縮時(shí)盆神經(jīng)傳入(夾傷盆神經(jīng)記錄點(diǎn)的周圍端)電位信號(hào)或傳出(夾傷記錄點(diǎn)的中樞端)電

4、位信號(hào)，并同步測(cè)定陰部神經(jīng)運(yùn)動(dòng)支電位、尿道外括約肌肌電及腹肌肌電的反射反應(yīng)。對(duì)各神經(jīng)電位和肌電圖進(jìn)行不穩(wěn)定收縮前和不穩(wěn)定收縮時(shí)的放電頻率和幅度量化統(tǒng)計(jì)和比較。 4.分別對(duì)T8胸段脊髓中樞及控制膀胱的周圍神經(jīng)進(jìn)行截?cái)鄵p傷，觀察OAB大鼠在膀胱充盈測(cè)壓(模式A)和等容(模式B)兩種情況下不穩(wěn)定收縮的前后改變，具體截?cái)喟═8段脊髓截?cái)?、雙側(cè)盆神經(jīng)截?cái)?、腹交感干截?cái)唷⒑碗p側(cè)陰部神經(jīng)截?cái)?。統(tǒng)計(jì)并比較膀胱基礎(chǔ)壓、不穩(wěn)定收縮壓在截?cái)嗲昂蟮淖?/p>

5、化和差異。 5.進(jìn)行OAB大鼠逼尿肌離體肌條實(shí)驗(yàn)，在OAB離體逼尿肌條紀(jì)錄實(shí)驗(yàn)中，為使得離體逼尿肌從去中樞控制狀態(tài)到完全去神經(jīng)影響的狀態(tài)，引入一種含有多種神經(jīng)受體阻滯劑的Cocktail混合液。摘取OAB大鼠膀胱，分離獲得離體平滑細(xì)肌條，進(jìn)行一定初張力下的等長(zhǎng)收縮實(shí)驗(yàn)和電刺激試驗(yàn)，紀(jì)錄在含有Cocktail混合液干預(yù)前后的37℃生理液孵浴下，OAB離體逼尿肌的電刺激收縮反應(yīng)和肌條自發(fā)興奮收縮變化特征，分別比較這兩種收縮的幅度和頻

6、率在Cocktail干預(yù)前后差異。 結(jié)果： 1.三種不同的方法形成的BOO狀態(tài)在經(jīng)充盈測(cè)壓后確定的OAB大鼠在膀胱重量及尿動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較之間均無(wú)明顯差異，但和正常大鼠均有顯著差異。 2.膀胱充盈測(cè)壓下(模式A)的同步神經(jīng)肌電生理記錄，依據(jù)不穩(wěn)定收縮前和不穩(wěn)定收縮時(shí)盆神經(jīng)傳入、傳出及相關(guān)神經(jīng)肌電反應(yīng)電位頻率或幅度是否存在顯著變化，不穩(wěn)定收縮可觀察到兩種類型，分別為收縮較大的B-Poab和較小的S-Poab。前者

7、同步盆神經(jīng)傳入、傳出的信號(hào)統(tǒng)計(jì)增加顯著，并且能引發(fā)陰部神經(jīng)、尿道外括約肌電圖和腹肌肌電圖反應(yīng)的顯著變化。而S-Poab則均沒(méi)有上述盆神經(jīng)傳入、傳出及相關(guān)神經(jīng)神經(jīng)肌電反應(yīng)變化。 3.膀胱等容測(cè)壓情況下(模式B)的同步神經(jīng)肌電生理記錄，發(fā)現(xiàn)膀胱基礎(chǔ)壓力升高，但同樣出現(xiàn)和前面充盈測(cè)壓模式A相似的充盈.排尿周期相似的排尿樣收縮周期，在排尿樣收縮的間期，也出現(xiàn)不穩(wěn)定收縮。并且同樣依據(jù)上述同步化神經(jīng)肌電生理記錄反應(yīng)的不同，不穩(wěn)定收縮分為有盆

8、神經(jīng)傳入、傳出信號(hào)變化和相關(guān)神經(jīng)肌電生理反射的B-Poab和均沒(méi)有神經(jīng)肌電變化和反射的S-Poab。 4.脊髓中樞截?cái)嗪髮?duì)OAB大鼠不穩(wěn)定收縮影響的結(jié)果： T8脊髓截?cái)嗪?，在充盈測(cè)壓情況下(模式A)，膀胱失去充盈.排尿收縮周期，膀胱基礎(chǔ)壓顯著升高，其中B-Poab不穩(wěn)定收縮消失，S-Poab仍然存在，并且幅度比截?cái)嗲吧杂猩仙?，但無(wú)顯著差異。 在膀胱等容測(cè)壓下(模式B)，T8脊髓截?cái)嗪蟀螂资ヅ拍驑邮湛s周期，膀胱基

9、礎(chǔ)壓顯著升高，B-Poab消失，S-Poab幅度稍有上升，但和損傷前無(wú)顯著差異。 5.膀胱周圍神經(jīng)逐步截?cái)嗪髮?duì)OAB大鼠不穩(wěn)定收縮影響的結(jié)果：膀胱的外周神經(jīng)逐步截?cái)嘁琅枭窠?jīng)、交感神經(jīng)、和陰部神經(jīng)的次序，在充盈測(cè)壓下(模式A)，膀胱失去充盈-排尿收縮周期，膀胱基礎(chǔ)壓顯著升高，不穩(wěn)定收縮中B-Poab消失，S-Poab保留且前后無(wú)顯著差異。在陰部神經(jīng)損傷時(shí)還觀察到膀胱基礎(chǔ)壓顯著下降。 在膀胱等容測(cè)壓下(模式B)，膀胱失去排尿

10、樣收縮周期，基礎(chǔ)膀胱壓同樣顯著升高，B-Poab不穩(wěn)定收縮消失，S-Poab不穩(wěn)定收縮仍然存在并改變不明顯。 6.0AB大鼠逼尿肌離體肌條實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在離體肌條刺激收縮實(shí)驗(yàn)中，Cocktail能有效消除電刺激使膀胱產(chǎn)生的收縮，說(shuō)明Cocktail能消除逼尿肌局部神經(jīng)因素的影響。在OAB膀胱離體肌條自發(fā)興奮收縮實(shí)驗(yàn)中，在加入Cocktail前后OAB肌條的自發(fā)興奮收縮并沒(méi)有被消除和降低，并且幅度有顯著上升。 結(jié)論：

11、1.0AB膀胱不穩(wěn)定收縮可能存在兩種機(jī)制，即B-Poab和S-Poab。前者有盆神經(jīng)傳入、傳出信號(hào)參與，這可能是尿急癥狀產(chǎn)生的神經(jīng)信號(hào)基礎(chǔ)，并且此種不穩(wěn)定收縮能引發(fā)其它相關(guān)的神經(jīng)肌電生理反射。而S-Poab沒(méi)有中樞信號(hào)參與其收縮，也沒(méi)有產(chǎn)生膀胱感覺(jué)并傳入中樞和引發(fā)其它相關(guān)神經(jīng)肌電生理反射。 2.脊髓及膀胱周圍神經(jīng)損傷后B-Poab消失，而S-Poab不會(huì)因此截?cái)喽鴾p弱。這更加確立了OAB膀胱部分不穩(wěn)定收縮有神經(jīng)因素參與，這成為解

12、釋尿急及相關(guān)繼發(fā)癥狀的基礎(chǔ)，但同時(shí)也證明了OAB膀胱有獨(dú)立于神經(jīng)控制影響的不穩(wěn)定收縮，并且這種不穩(wěn)定收縮的產(chǎn)生并不依賴于中樞和周圍神經(jīng)。 3.離體的OAB逼尿肌在進(jìn)一步消除膀胱局部神經(jīng)因素的情況下，證實(shí)其過(guò)度的自發(fā)興奮收縮沒(méi)有減弱，說(shuō)明OAB肌條的自發(fā)收縮有來(lái)自逼尿肌本身的興奮，這可能是在體狀態(tài)時(shí)不穩(wěn)定收縮起源和存在的逼尿肌自身因素基礎(chǔ)。 第二部分：過(guò)度活躍膀胱中雷諾定受體的初步研究 背景和目的： 在本部

13、分的研究中擬考察OAB膀胱逼尿肌內(nèi)RyR通道的mRNA、蛋白表達(dá)是否存在改變，和RyR通道在OAB逼尿肌中對(duì)膜興奮性及自發(fā)收縮調(diào)控功能等影響是否有顯著變化，擬初步探討它的改變與OAB中自發(fā)興奮收縮過(guò)度可能聯(lián)系。 材料和方法： 1.通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定OAB大鼠模型逼尿肌組織的RyR通道亞型表達(dá)，通過(guò)β-action內(nèi)參照半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，分析確認(rèn)RyR通道m(xù)RNA表達(dá)在OAB膀胱逼尿肌與正常膀胱逼尿肌之間是否存

14、在差異。通過(guò)RyR通道蛋白westernblot分析確認(rèn)RyR通道蛋白表達(dá)在OAB膀胱逼尿肌與正常膀胱逼尿肌之間是否存在差異。 2.正常離體膀胱肌條在Cocktail-PSS生理液中消除了局部神經(jīng)因素影響后，分別應(yīng)用VDCC鈣通道阻滯劑(nimodipine)、RyR通道激動(dòng)劑(caffeine)、和RyR通道阻滯劑(ryanodine)的情況下，觀察和比較干預(yù)前后其自發(fā)興奮收縮幅度和頻率改變情況。同樣對(duì)于OAB膀胱離體肌條進(jìn)行

15、觀察，分析前后自發(fā)興奮收縮頻率和幅度變化，并且和正常進(jìn)行比較，分析受藥物干預(yù)后對(duì)自發(fā)興奮收縮調(diào)控的差異。 結(jié)果： 1.RT-PCR提示OAB膀胱逼尿肌中RyR只表達(dá)RyR2亞型，和正常對(duì)照無(wú)亞型差異。半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)和westernblot分析實(shí)驗(yàn)顯示RyR通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)在OAB膀胱平滑肌中與正常逼尿肌相比都有顯著降低。 2.在Cocktail-PSS生理液孵浴中，對(duì)已有穩(wěn)定自發(fā)性收縮的離體逼尿肌條

16、紀(jì)錄中，當(dāng)加入RyR通道阻滯劑ryanodine后，正常組離體肌條自發(fā)收縮的頻率顯著升高，且升高后的頻率特征和OAB膀胱離體肌條組頻率比較無(wú)顯著差異；而OAB組在ryanodine給予后自發(fā)收縮改變不顯著。在caffeine應(yīng)用后顯示能顯著抑制自發(fā)收縮活性，無(wú)論是OAB膀胱離體肌條還是正常離體肌條紀(jì)錄中都是如此。在L-型Ca2+通道阻滯劑nimodipine給予后，能消除正常膀胱離體肌條自發(fā)收縮，對(duì)OAB膀胱離體肌條的自發(fā)收縮也幾乎被消

17、除，但仍還殘留有微小收縮節(jié)律。 結(jié)論： RyR通道在正常逼尿肌的自發(fā)收縮中起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，提示可能原因在于RyR通道的“鈣閃爍”激活膜上Kca通道及和抑制VDCC通道的鈣內(nèi)流，從而降低膜興奮性和收縮活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)OAB膀胱逼尿肌中RyR通道在離體的自發(fā)收縮活性調(diào)節(jié)中功能減弱和它的表達(dá)顯著降低。提示RyR通道在正常逼尿肌自發(fā)收縮中負(fù)性作用機(jī)制在OAB膀胱逼尿肌中表現(xiàn)明顯減弱，這可能是導(dǎo)致OAB膀胱逼尿肌自發(fā)收縮的過(guò)度活躍