肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的篩選與鑒定.pdf

1、肝內(nèi)膽汁淤積是多種肝病的重要病理改變，其可以加重肝臟損害，加速肝硬化、肝功能衰竭的進(jìn)程。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，各種原因?qū)е碌母窝谆颊咭坏┖喜⒂懈蝺?nèi)膽汁淤積，則病情進(jìn)展速度加快，短期內(nèi)即可進(jìn)展到肝硬化期，甚至發(fā)展為重癥肝炎，肝功能衰竭而死亡，治療上非常困難，常無有效的治療措施。 目前研究認(rèn)為，肝臟對代謝產(chǎn)物或異物的排泄是通過分布在肝細(xì)胞膽管膜側(cè)的轉(zhuǎn)動體來完成的，這種轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能的，需要ATP 的參與。這被認(rèn)為是代謝產(chǎn)物或異物排出肝細(xì)胞的

2、終末環(huán)節(jié)。有學(xué)者也將這一環(huán)節(jié)稱為肝細(xì)胞的第Ⅲ相反應(yīng)。第Ⅲ相反應(yīng)異?？赡苁歉蝺?nèi)膽汁淤積性肝病最重要的發(fā)病機(jī)制。 因此，肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜膽汁排泄相關(guān)分子的研究也成為肝內(nèi)膽汁淤積性肝病領(lǐng)域的研究熱點。近年來，雖然在肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些與膽汁排泄相關(guān)的分子，明確了一些疾病的病因及發(fā)病機(jī)制，使一些肝內(nèi)膽汁淤積疾病得到了及時診斷及治療，然而，發(fā)現(xiàn)的這些分子還遠(yuǎn)不能解決所有肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的問題。 因此，建立具有功能的

3、肝細(xì)胞膽管膜側(cè)體外轉(zhuǎn)運(yùn)模型，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜上新的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子，對于進(jìn)一步明確肝臟的復(fù)雜生理功能及肝內(nèi)膽汁淤積性肝病發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。 實驗?zāi)康模悍蛛x肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜和血竇側(cè)細(xì)胞膜，建立具有功能的肝細(xì)胞膽管膜側(cè)體外轉(zhuǎn)運(yùn)模型，篩選與鑒定大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子。 材料和方法： 1．大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜的提取與鑒定 （1）以percoll 和蔗糖溶液為密度梯度介質(zhì)，利用密度梯度離心法分離

4、大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體(CMV) 和血竇側(cè)膜小體(SMV) ； （2）通過SDS-PAGE、酶學(xué)分析和透射電鏡掃描對之性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定； （3）以Mrp2特異性轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)E217βG 為轉(zhuǎn)運(yùn)底物，利用轉(zhuǎn)運(yùn)試驗觀察CMV 的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。 2．大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子抗體的篩選 （1）以大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體為免疫原，免疫BALB/C 小鼠，進(jìn)行單克隆抗體的制備； （2）利用比較ELISA 法

5、、免疫組化和體外轉(zhuǎn)運(yùn)試驗篩選抗大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的抗體； （3）用腹水制備法大量制備單克隆抗體，并用飽和硫酸銨法進(jìn)一步純化抗體； （4）利用抗體亞類和亞型檢測試劑盒對抗體進(jìn)行亞類和亞型的檢測； （5）利用Western blot 對篩選到的抗體所識別的目的蛋白進(jìn)行分子量的鑒定。 3. 大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的抗原鑒定 (1) 利用雙向電泳，進(jìn)一步鑒定抗體所識別抗原的理

6、化性質(zhì)； （2）利用免疫沉淀，雙向電泳，Western blot 等技術(shù)獲取抗體所識別抗原的蛋白條帶； （3）利用肽指紋圖譜測序，數(shù)據(jù)庫軟件分析的方法分析蛋白條帶，初步明確抗體所識別抗原的蛋白質(zhì)信息。 結(jié)果： 1．大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜的提取與鑒定情況 以percoll 和蔗糖溶液為密度梯度介質(zhì)，利用密度梯度離心法成功地提取出了大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體(CMV)和血竇側(cè)膜小體(SMV)，SDS-PA

7、GE 結(jié)果顯示：分離的肝細(xì)胞膜蛋白與肝細(xì)胞勻漿蛋白存在著明顯蛋白條帶的差異；同時肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜和血竇側(cè)細(xì)胞膜也有一些蛋白條帶的不同。堿性磷酸酶是肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜的標(biāo)志物，Na+-K+ ATPase 則是肝細(xì)胞血竇側(cè)細(xì)胞膜的標(biāo)志物。堿性磷酸酶和Na+-K+ ATPase 特異性酶學(xué)分析顯示：CMV 的堿性磷酸酶活性是SMV 的5.2 倍，而SMV 的Na+-K+ ATPase 活性是CMV 的5.7 倍，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。透射電鏡掃

8、描：CMV 和SMV，為大小均一，直徑約450nm 的膜性囊泡。體外轉(zhuǎn)運(yùn)實驗證實：分離得到的CMV 具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性。 2．大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子抗體的篩選 以提取的大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體為免疫原，免疫BALB/C 小鼠，通過多次融合，利用比較ELISA 法、獲得了46 株在大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜高表達(dá)分子的單克隆抗體。免疫組化組織定位結(jié)果顯示：所得到的46 株抗體在大鼠肝組織中的表達(dá)分布不盡相同。其中一株單克隆

9、抗體特異性地定位于大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜上，命名為cm1,抗體亞類和亞型為IgG2a/κ型。Westernblot 定量分析，也證實其在肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜表達(dá)量明顯高于血竇側(cè)細(xì)胞膜的表達(dá)量，其所識別抗原的分子量約為140kDa。另外，有兩株抗體在肝組織中表達(dá)呈特異性分布。一株抗體在大鼠肝小葉中央靜脈周圍肝實質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在肝小葉的匯管區(qū)周圍肝實質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，命名為cv1；有趣的是cv1 在人肝臟組織中表達(dá)在肝細(xì)胞的血竇側(cè)細(xì)胞膜

10、上以及肝血竇腔某種肝非實質(zhì)細(xì)胞中，而在人和鼠肝組織中其所識別抗原的分子量均約為25kDa。另一株抗體特異性地表達(dá)在肝細(xì)胞核膜上，命名為nm1，其所識別抗原的分子量約為50kDa。有關(guān)這46 株抗體的體外轉(zhuǎn)運(yùn)功能篩選還在進(jìn)一步的進(jìn)行中。 3. 大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的抗原鑒定 我們首先對cm1、cv1 和nm1 這3 株抗體所識別的抗原進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。免疫沉淀、肽指紋圖譜測序結(jié)果提示：cm1 可能是一種新的

11、表達(dá)在大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜上的特異性分子。雙向電泳、Western blot 結(jié)果顯示，cv1 識別抗原的等電點約為3-4；nm1 抗體所識別的抗原為ATP 合成亞單位β（ATPB）。 結(jié)論： 我們首次在國內(nèi)利用密度梯度離心法成功分離出了大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜和血竇側(cè)細(xì)胞膜，建立了具有功能的肝細(xì)胞膽管膜側(cè)體外轉(zhuǎn)運(yùn)模型。該模型的建立，為進(jìn)一步明確已知轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子的生理功能及發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子提供了有利的工具和手段，隨著

12、該模型的廣泛應(yīng)用，將為進(jìn)一步明確肝臟復(fù)雜的生理功能及肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的發(fā)病機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。利用提取的大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體為免疫原，通過比較ELISA 法，篩選獲得了46 株在大鼠肝細(xì)胞膽管側(cè)細(xì)胞膜高表達(dá)分子的單克隆抗體。其中，一株單抗特異性地結(jié)合在肝細(xì)胞膽管膜側(cè)，我們將其命名為cm1，經(jīng)免疫沉淀及肽指紋質(zhì)譜測序，與已知轉(zhuǎn)運(yùn)分子進(jìn)行比較分析，推測其可能為轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的新分子。第二株單抗，特異性地結(jié)合在大鼠肝小葉中央靜脈周圍肝實質(zhì)細(xì)胞胞