Vero細(xì)胞膜上與日本腦炎病毒結(jié)合分子的初步篩選.pdf

1、日本腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是具有包膜的單股正鏈RNA病毒，可引起急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，即日本腦炎（Japaneseencephalitis，JE），重癥病死率可達(dá)5％～10％，幸存者后遺癥也在15％左右，嚴(yán)重威脅人類生命健康。近年來，JE的流行地域有不斷擴(kuò)大的趨勢，已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，更可作為潛在的生物戰(zhàn)劑使用，其重要性不容忽視。
　　

2、盡管目前關(guān)于JE的預(yù)防、診斷、治療等都已經(jīng)有了較完善的方案，但其致病機(jī)理一直未明確，尤其是作為感染始動(dòng)因素的JEV受體（JEVR）迄今尚未闡明。病毒與細(xì)胞膜受體的特異性結(jié)合是引發(fā)病毒感染宿主細(xì)胞的始動(dòng)環(huán)節(jié)，同時(shí)在決定病毒宿主特異性和細(xì)胞親嗜性方面起著重要作用。研究受體對(duì)于揭示病毒感染與免疫學(xué)機(jī)制，深入了解病毒與宿主細(xì)胞間相互關(guān)系，研制更有效的病毒疫苗，篩選診斷試劑和抗病毒藥物等都具有重要的意義。本研究課題旨在篩選非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero

3、細(xì)胞）膜上可與JEV結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，為最終確定JEV在Vero細(xì)胞膜上的受體奠定基礎(chǔ)。
　　本研究采用溫和的非離子型去垢劑NP-40裂解提取Vero細(xì)胞膜蛋白，將未經(jīng)凍存的新鮮膜蛋白樣品與純化后的JEV及抗JEV單克隆抗體（mAb）2H4進(jìn)行免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP），收集可與JEV結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，繼而經(jīng)SDS-PAGE，從上述復(fù)合物中分離出3條獨(dú)立的特異條帶，相對(duì)分子量分別為90

4、kDa、45kDa和34kDa。將這3條蛋白條帶從SDS-PAGE膠上切下約呈1mm3小塊，進(jìn)行質(zhì)譜（MS）分析，檢索人蛋白數(shù)據(jù)庫。結(jié)果提示，分子量約為90kDa的蛋白為熱休克蛋白90β（HSP90β），45kDa和34kDa均為未命名蛋白產(chǎn)物（unnamedproteinproduct）。用抗HSP90βmAb進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，所得結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s，n=4)表示，細(xì)胞本底的熒光百分比為1.64±0.06；JEV（MO

5、I1）與細(xì)胞的結(jié)合率用熒光百分比表示為89.9±0.72；加入抗HSP90β（1:50）后，JEV與細(xì)胞間的結(jié)合下降熒光百分比為79.91±1.9(P<0.05)；加入抗HSP90β的濃度提高為1:10時(shí)，JEV與細(xì)胞間的結(jié)合下降熒光百分比為68.28±2.79(P<0.05)。證明抗HSP90βmAb可以明顯抑制JEV與Vero細(xì)胞結(jié)合。免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）也得到同樣的結(jié)果。
　　上述結(jié)果初步表明Vero細(xì)胞膜表面存在的HSP