miR-130a與miR-212在HepG2和HepG2-Adr中表達(dá)差異鑒定.pdf

1、背景及目的:
　　肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且致死率極高。全身化療作為中晚期肝癌患者的重要治療手段之一，其療效并不理想，主要原因是肝癌的多藥耐藥。肝癌多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為其主要機(jī)制包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排，凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，各類酶介導(dǎo)的耐藥等。其中膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的肝癌多藥耐藥機(jī)制是最重要的機(jī)制。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的P-gp蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，且在耐藥細(xì)胞中這種高表達(dá)更為

2、明顯。ABCG2蛋白的表達(dá)則與藥物環(huán)境有關(guān)，在藥物環(huán)境中，其表達(dá)增加，可以加速肝癌細(xì)胞內(nèi)藥物的外排，因此P-gp和ABCG2蛋白在肝癌膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排泵機(jī)制中起重要作用。miRNA是一種由21-25個核苷酸組成的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一類在進(jìn)化上高度保守的不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，參與轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，并對細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控，與人類多種疾病相關(guān)。目前大量研究表明miRNA作為抑癌基

3、因或癌基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系。有報道顯示miR-130a和miR-212通過不同的機(jī)制參與了多種腫瘤的多藥耐藥，但與肝癌的相關(guān)報道少見，且很多機(jī)制尚不明確。因此本研究以HepG2細(xì)胞和HepG2/Adr細(xì)胞（阿霉素耐藥HepG2細(xì)胞）為對象，采用miRNA芯片技術(shù)尋找與肝癌耐藥膜蛋白相關(guān)的差異miRNA，并通過qPCR技術(shù)對候選的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，旨在深入地了解有哪些miRNA可能參與了對肝癌耐藥蛋白及編碼基因的調(diào)

4、控，為后續(xù)對篩選出來的miRNA進(jìn)行功能學(xué)檢測提供研究基礎(chǔ)。該研究將進(jìn)一步揭示肝癌耐藥機(jī)制，有助于為提高肝癌的綜合治療療效尋找到一條新途徑。
　　方法:
　　1.運(yùn)用MTT法對HepG2與HepG2/Adr細(xì)胞對阿霉素的耐藥性差異進(jìn)行檢測
　　2.運(yùn)用Exiqon miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測3100條人，小鼠，大鼠三物種全部miRNA以及上述三物種相關(guān)的所有病毒的miRNA以及25個miRPlusTM人miRNA在H

5、epG2與HepG2/Adr細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平差異，應(yīng)用分層聚類分析獲得差異表達(dá)的miRNA譜，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道選擇miR-130a和miR-212作為候選miRNA。
　　3.運(yùn)用qPCR技術(shù)對HepG2與HepG2/Adr細(xì)胞中MDR1，ABCG2，miR-130a，miR-212基因表達(dá)進(jìn)行檢測，qPCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。
　　4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使

6、用單因素方差分析及t檢驗(yàn)來比較組間差異，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.HepG2/Adr細(xì)胞對阿霉素的耐藥指數(shù)是HepG2細(xì)胞的2.968倍，HepG2/Adr細(xì)胞對ADM具有更強(qiáng)的耐藥性。
　　2.miRNA芯片檢測結(jié)果表明存在HepG2/Adr特異性的miRNA譜，共篩選出236個差異表達(dá)的miRNA，其中118個miRNA上調(diào)，118個miRNA下調(diào)。納入標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)和下調(diào)均超過2倍。mi

7、R-130a和miR-212在耐藥株和非耐藥株中存在明顯差異。
　　3.通過qPCR法檢測我們發(fā)現(xiàn)，在HepG2中MDR1基因相對表達(dá)量是在HepG2/Adr中的0.094倍(P＜0.05);在HepG2中ABCG2基因相對表達(dá)量是在HepG2/Adr中的0.47倍(P＜0.05);在HepG2中miR-130a基因相對表達(dá)量是在HepG2/Adr中的4.057倍(P＜0.05);在HepG2中miR-212基因相對表達(dá)量是在He

8、pG2/Adr中的5.434倍(P＜0.05)，結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.HepG2/Adr具有特異性的miRNA表達(dá)譜，這些特異性的miRNA可能參與了肝癌多藥耐藥的調(diào)控。
　　2.MDR1和ABCG2在HepG2/Adr株中上調(diào)，MDR1和ABCG2可能共同參與了肝癌膜蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制。
　　3.miR-130a和miR-212在HepG2/Adr細(xì)胞株中下調(diào)，兩者是否參與肝癌膜蛋白的