TOB1對人類肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和放射敏感性的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、SOOCHOWUNIVERSITY七年制碩士專業(yè)學(xué)位論文論文題目TOB1對人類肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和放射敏感性的影響及機(jī)制的研究研究生姓名孫克康指導(dǎo)教師姓名焦旸專業(yè)名稱臨床醫(yī)學(xué)研究方向腫瘤放射生物學(xué)論文提交日期2012年5月TOB1對人類肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和放射敏感性的影響及機(jī)制的研究對人類肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和放射敏感性的影響及機(jī)制的研究摘要I摘要目的：本課題通過建立TOB1穩(wěn)定高表達(dá)及表達(dá)抑制的肺癌細(xì)胞株，研究TOB1在體外對肺癌細(xì)胞增

2、殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及放射敏感性的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法：采用RTPCR和Westernblot法檢測人類正常支氣管上皮細(xì)胞HBE和八種肺癌細(xì)胞株中TOB1表達(dá)水平的差異，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及G418篩選，建立TOB1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，同時采用RNA干擾法抑制TOB1的表達(dá)；應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、體外劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)研究TOB1對肺癌細(xì)胞95D和A549增殖、細(xì)胞周期分布以及轉(zhuǎn)移侵襲的影響。采用Westernb

3、lot和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測TOB1對肺癌細(xì)胞中細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)活性的影響。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測TOB1對肺癌細(xì)胞電離輻射后克隆形成能力、細(xì)胞周期分布及γH2AXfoci形成數(shù)目的影響，同時應(yīng)用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測TOB1對肺癌細(xì)胞電離輻射后細(xì)胞周期及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控。采用免疫共沉淀及Westernblot法初步探討其相關(guān)機(jī)制。結(jié)果：成功構(gòu)建

4、TOB1高表達(dá)的95D和NCIH1975細(xì)胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)TOB1高表達(dá)顯著抑制95D細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力，并引起95D細(xì)胞發(fā)生明顯的G1期阻滯。Westernblot及明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TOB1高表達(dá)下調(diào)95D細(xì)胞中周期相關(guān)CyclinD1、CyclinB1、CyclinE以及αcatenin、βcatenin、γcatenin、MMP2、MMP9等轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時抑制MMP2、MMP9的活性。TOB1高表達(dá)顯著降低NC

5、IH1975細(xì)胞的克隆形成能力，降低電離輻射引起的肺癌細(xì)胞G2M期阻滯，增加電離輻射引起的γH2AXfoci的數(shù)目。Westernblot結(jié)果顯示TOB1高表達(dá)降低DNAPKcs、Ku70、Ku80、XRCC4的表達(dá)。利用siRNA抑制肺癌A549細(xì)胞中TOB1的表達(dá)在增殖、轉(zhuǎn)移及放射敏感性方面與TOB1高表達(dá)均呈現(xiàn)相反的表現(xiàn)。免疫共沉淀及Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TOB1與PTEN存在相互結(jié)合，并且TOB1影響EGFRMAPK信號