轉(zhuǎn)錄因子MdHB1調(diào)控‘澳洲青蘋’蘋果花青苷合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、果實(shí)著色情況在很大程度上影響了果實(shí)的商品特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。蘋果（Malus×domestica）果皮和果肉的紅色性狀主要是由花青苷累積造成的，紅肉蘋果因富含花青苷而具有重要的經(jīng)濟(jì)和生物學(xué)價(jià)值。花青苷積累調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)果實(shí)品質(zhì)提高和紅肉蘋果分子育種均有重要意義。
　　HD-Zip蛋白是植物界所特有的一大類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境防御反應(yīng)，但其與花青苷積累間的關(guān)系尚不明晰。本研究從‘澳洲青蘋’中克隆得到了一個(gè)HD-Zip

2、Ⅰ轉(zhuǎn)錄因子MdHB1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)研究明確了MdHB1與‘澳洲青蘋’果肉花青苷積累的調(diào)控關(guān)系，并結(jié)合生理、生化實(shí)驗(yàn)揭示了MdHB1調(diào)控花青苷合成的可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)MdHB1蛋白含有336個(gè)氨基酸，屬于HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子家族。進(jìn)化樹(shù)分析得知，蘋果的MdHB1、番茄的LeHB1和擬南芥的AtHB1緊密聚類在一起。定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MdHB1在‘澳洲青蘋’的花、葉、果等組織中均有表

3、達(dá);在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，MdHB1在幼果期和可采成熟期果實(shí)的果肉中轉(zhuǎn)錄水平較高。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子誘導(dǎo)下，MdHB1-GFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布，同時(shí)在細(xì)胞核內(nèi)聚集;MdHB1啟動(dòng)子誘導(dǎo)下，GFP熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
　　(2)在可采成熟度的‘澳洲青蘋’果實(shí)中沉默MdHB1可以導(dǎo)致其果肉組織中積累大量紅色物質(zhì)。高效液相色譜鑒定得知，該紅色物質(zhì)主要為矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷，屬于花青苷類物質(zhì)。定量RT-

4、PCR分析表明，沉默MdHB1基因可顯著提高花青苷合成結(jié)構(gòu)基因(MdDFR和MdUFGT)和調(diào)控基因（MdMYB10）的轉(zhuǎn)錄豐度。相反，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MdHB1降低了紅肉蘋果‘芭蕾’果肉花青苷的含量及MdDFR、MdUFGT和MdMYB10的轉(zhuǎn)錄水平;穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MdHB1的轉(zhuǎn)基因‘NC89’煙草（Nicotiana tabacum）花冠顏色比野生植株的花冠顏色淺，花青苷合成受到顯著抑制。由此可見(jiàn)，HD-ZipⅠ轉(zhuǎn)錄因子MdHB1組織特異性地

5、負(fù)調(diào)控花青苷合成，且該過(guò)程與DFR、UFGT和MYB10等基因的表達(dá)密切相關(guān)。
　　(3)利用雙熒光素酶系統(tǒng)和GUS報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，MdMYB10激活MdDFR和MdUFGT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，這種作用可被MdbHLH3和MdTTG1轉(zhuǎn)錄因子加強(qiáng);MdHB1抑制MdDFR和MdUFGT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，并干擾MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1轉(zhuǎn)錄因子對(duì)上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母單雜

6、交實(shí)驗(yàn)顯示，MdHB1不結(jié)合MdDFR和MdUFGT啟動(dòng)子序列，即MdHB1間接負(fù)調(diào)控MdDFR和MdUFGT的表達(dá)。
　　(4)在‘澳洲青蘋’果肉中，沉默MdMYB10可抑制花青苷合成關(guān)鍵基因MdDFR和MdUFGT的轉(zhuǎn)錄;MdHB1沉默所產(chǎn)生的紅肉表型在共沉默MdMYB10和MdHB1時(shí)消失。由此可見(jiàn)，MdMYB10對(duì)于果肉著色是必不可少的。
　　(5)GUS報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，MdHB1和MdMYB10在煙草中均

7、抑制MdMYB10和MdHB1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，推測(cè)MdHB1和MdMYB10在‘澳洲青蘋’中互相負(fù)調(diào)控。
　　(6)酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)結(jié)果顯示，兩個(gè)MdHB1蛋白可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合形成同源二聚體;MdHB1蛋白與MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1蛋白的結(jié)合也發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中與MdbHLH3的結(jié)合最弱，與MdMYB10-MdbHLH3-MdTTG1復(fù)合物的結(jié)合最強(qiáng)。
　　綜上所述，推導(dǎo)出一個(gè)MdHB1負(fù)調(diào)

8、控‘澳洲青蘋’果肉花青苷合成的模型:正常條件下，MdHB1募集MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1轉(zhuǎn)錄因子，將其束縛在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，間接抑制MdDFR和MdUFGT基因的表達(dá);當(dāng)通過(guò)RNA干擾等途徑降低Md HB1基因的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)，MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1轉(zhuǎn)錄因子被釋放，并于細(xì)胞核內(nèi)激活花青苷合成關(guān)鍵基因MdDFR和MdUFGT的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)花青苷的積累，進(jìn)而導(dǎo)致‘澳洲青蘋’果肉呈現(xiàn)紅色。本研究不僅拓展了HD-Zi