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文檔簡介
1、人類的分娩發(fā)動機(jī)制復(fù)雜,其動因尚不清楚,早產(chǎn)及過期產(chǎn)是增加圍產(chǎn)兒病死率的重要原因。因此,對分娩發(fā)動這一生理過程及其機(jī)制的進(jìn)一步研究是防治早產(chǎn)及過期產(chǎn)的關(guān)鍵。 研究發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotrophin-releas-ing hormone,CRH)在子宮收縮和分娩發(fā)動中起重要作用,認(rèn)為可能是分娩發(fā)動的啟動因子。但其具體機(jī)制目前還不清楚。間隙連接蛋白-43(Connexin-43,Cx43)在子宮平滑肌中表達(dá)增
2、加是子宮收縮分娩發(fā)動的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(Activator-protein-1,AP-1)能與許多基因上的AP-1位點(diǎn)結(jié)合,參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。在Cx43基因的啟動子區(qū)域有AP-1結(jié)合位點(diǎn),AP-1可促進(jìn)Cx43的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá);已有研究表明,AP-1亞單位c-Fos在Cx43的表達(dá)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。因此,我們設(shè)想從基因水平特異性的阻斷子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)AP-1的活性而競爭性抑制Cx43的表達(dá),進(jìn)而阻止分娩發(fā)動,
3、為早產(chǎn)的防治提供新的思路。Decoy核酸技術(shù)作為一個新的基因治療策略,可特異性的阻斷核轉(zhuǎn)錄因子的活性而抑制下游基因的表達(dá)。為證實(shí)我們的設(shè)想,并為利用AP-1 decoy寡核苷酸(ODN)類藥物防治早產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ),本研究借助陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),首次應(yīng)用AP-1 decoy ODN競爭性地阻斷子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)AP-1的活性,進(jìn)行了以下二個方面的研究。 第一部分促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、c-Fos及間隙連接蛋白
4、-43在分娩發(fā)動中的相關(guān)性研究目的探討促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotrophin-releas-ing hormone,CRH)、c-Fos和間隙連接蛋白-43(Connexin-43,Cx43)在足月妊娠子宮平滑肌中的表達(dá)變化及它們在分娩發(fā)動中的相關(guān)性。 方法;選擇2006年2月~2006年9月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院住院足月臨產(chǎn)產(chǎn)婦30例(in labor,L組),足月未臨產(chǎn)產(chǎn)婦30例(notin labor,NL組
5、),未孕婦女因?qū)m頸內(nèi)瘤樣病變行子宮切除術(shù)患者30例(對照組in non-pregnant,NP組)。應(yīng)用放射免疫方法測定三組婦女靜脈血中CRH的含量;用核酸原位雜交技術(shù)和SP免疫組化法檢測子宮平滑肌中c-Fos、Cx43 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果;1)足月臨產(chǎn)組母血CRH水平(371.79±54.13 pg/ml)高于足月未臨產(chǎn)組(157.23±47.71 pg/ml),P<0.05,足月未臨產(chǎn)組高于對照組(5.68±3
6、.18 pg/ml),P<0.05。2)c-Fos mRNA及蛋白的陽性信號主要定位于子宮平滑肌細(xì)胞核內(nèi),少量位于細(xì)胞漿內(nèi);c-Fos在子宮平滑肌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)的陽性指數(shù):足月臨產(chǎn)組(5.44±1.66,5.36±1.52)分別高于足月未臨產(chǎn)組(4.14±0.88,3.86±0.90)及對照組(1.04±0.38,1.24±0.35),各組間存在顯著性差異,P<0.05。3)Cx43 mRNA及蛋白的陽性信號定位于子宮平滑肌
7、細(xì)胞漿內(nèi);Cx43在子宮平滑肌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)的陽性指數(shù):足月臨產(chǎn)組(5.48±1.43,5.58±1.28)分別高于足月未臨產(chǎn)組(4.08±0.58,4.10±0.52)及對照組(1.54±0.64,1.14±0.59),各組間存在顯著性差異,P<0.05。4)母血中CRH水平分別與子宮平滑肌組織中c-Fos mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r<,1>=0.62,r<,2>=0.50),P<0.05;與子宮平滑肌組織中Cx
8、43mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r<,3>=0.52,r<,4>=0.68),P<0.05;子宮平滑肌組織中c-FosmRNA和蛋白表達(dá)水平與Cx43mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r<,5>=0.51,r<,6>=0.60),P<0.05a 結(jié)論;母血中CRH水平、子宮平滑肌中c-Fos和間隙連接蛋白Cx43的表達(dá)水平與分娩發(fā)動密切相關(guān),且三者間表達(dá)變化呈正相關(guān)。 第二部分促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素通過核轉(zhuǎn)錄因
9、子c-fos/AP-1促進(jìn)人子宮平滑肌細(xì)胞間隙連接蛋白-43的表達(dá)目的探討人類促腎上腺素皮質(zhì)激素釋放激素對子宮平滑肌中Cx43的調(diào)節(jié)作用和c-Fos/AP-1激活的信號傳導(dǎo)途徑。 方法;原代培養(yǎng)人未孕子宮平滑肌細(xì)胞(從行子宮切除術(shù)的未孕患者獲得),給予不同濃度的CRH干預(yù),瞬時轉(zhuǎn)染AP-ldecoyoligodeoxynucleotide(ODN)以阻斷Cx43上的AP-1結(jié)合位點(diǎn);采用用免疫熒光檢測Cx43蛋白表達(dá),熒光素酶檢
10、測AP-1的活性,c-Fos和Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)分別用real-time RT-PCR和Western blot檢測。 結(jié)果;在未孕子宮平滑肌細(xì)胞,CRH促進(jìn)了Cx43的表達(dá),激活了AP-1啟動子的活性。CRH顯著增強(qiáng)c-fos、Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)(p<0.05),且有劑量依賴趨勢。轉(zhuǎn)染足量的含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的AP-1decoy ODN后,不影響CRH對c-Fos表達(dá)的調(diào)控,卻明顯抑制了Cx43mRNA和
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