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1、目的:口腔扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)是發(fā)生于口腔黏膜的一種常見的慢性非感染性炎性免疫反應(yīng)性疾病,該病頑固難治,反復(fù)遷延,世界衛(wèi)生組織將其列為癌前狀態(tài)。OLP致病機(jī)制復(fù)雜,尚無明確定論,近年來很多研究表明:細(xì)胞凋亡抑制是OLP的重要致病因素之一。值得關(guān)注的是核因子KB(nuclear factor kappaB,NF-kB),它的表達(dá)、活化及易位已成為研究自身免疫相關(guān)性疾病、各類炎性疾患及腫瘤的新焦點(diǎn),NF-
2、k B能夠抑制細(xì)胞的凋亡,它在OLP的發(fā)生、發(fā)展等方面具有重要調(diào)控作用,提示我們:抑制NF-k B活化的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將成為OLP臨床治療的新靶點(diǎn)。目前,OLP的治療尚無特異性藥物,其藥物研究受到諸多因素的影響,缺乏合適的藥物評(píng)價(jià)模型是OLP藥物研發(fā)的主要障礙。本實(shí)驗(yàn)從臨床病例出發(fā),建立體外穩(wěn)定可重復(fù)的人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,探討人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)方法和生物學(xué)特性,并初步研究核因子k B在培養(yǎng)人OLP角質(zhì)形
3、成細(xì)胞中的表達(dá)和定位,為今后建立基于NF-k B信號(hào)通路藥物篩選OLP體外細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法:選擇臨床及WHO標(biāo)準(zhǔn)病理確診的口腔扁平苔蘚患者黏膜活檢標(biāo)本,行OLP角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究。 1.細(xì)胞培養(yǎng):采用冷酶消化法分離細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng),相差顯微鏡下觀察和記錄細(xì)胞形態(tài)變化。cck-8法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,研究此細(xì)胞體外生長(zhǎng)的增殖情況。 2.細(xì)胞鑒定:間接免疫熒光法
4、進(jìn)行上皮細(xì)胞角蛋白的定性實(shí)驗(yàn),并設(shè)立陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及空白對(duì)照組。掃描電鏡和透射電鏡從超微結(jié)構(gòu)層面進(jìn)一步鑒定細(xì)胞特性。 3.核因子k B在培養(yǎng)人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)和定位的初步測(cè)定:采用間接免疫熒光法,單克隆NF-k Bp65抗體對(duì)扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞中活化的NF-kB進(jìn)行標(biāo)記,明確NF-k B的表達(dá)和定位。 結(jié)果: 1.Ⅰ型OLP(網(wǎng)狀、斑塊型)角質(zhì)形成細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng),可連續(xù)傳
5、5~6代,整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)期間為單一的角質(zhì)形成細(xì)胞,細(xì)胞為多角形,長(zhǎng)到一定密度呈現(xiàn)典型的鋪路石狀,符合上皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)特征。OLP角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”型,傳代周期約6~7d,一般7d左右能達(dá)90%以上融合。Ⅱ型OLP(萎縮、糜爛型)角質(zhì)形成細(xì)胞活力欠佳,不易生長(zhǎng),其培養(yǎng)條件需要進(jìn)一步摸索。 2.角蛋白間接免疫熒光反應(yīng)陽性,即角蛋白陽性表達(dá),陽性率達(dá)到90%以上,定位于胞漿,能夠鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為角質(zhì)成細(xì)胞。掃描電鏡顯示:細(xì)
6、胞周邊微絨毛呈輻射狀,長(zhǎng)短不一;細(xì)胞中央凸起為胞核部位,表面呈現(xiàn)白色高密度區(qū)域,此區(qū)域?yàn)槲⒔q毛豐富聚集,微絨毛是上皮細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)之一。透射電鏡顯示:細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量的空泡性結(jié)構(gòu),部分空泡內(nèi)有吞飲細(xì)胞器后的膜性結(jié)構(gòu),這一病理性變化與OLP組織的特征性超微結(jié)構(gòu)變化相一致,能夠進(jìn)一步鑒定我們培養(yǎng)的細(xì)胞為OLP角質(zhì)形成細(xì)胞。 3.OLP角質(zhì)形成細(xì)胞中部分細(xì)胞NF-k Bp65陽性表達(dá),定位于胞核,表明體外培養(yǎng)的OLP角質(zhì)形成細(xì)胞存
7、在NF-k Bp65的活化,陽性對(duì)照組OLP黏膜上皮基底層及棘細(xì)胞層NF-kBp65陽性表達(dá),同時(shí)固有層浸潤淋巴細(xì)胞亦見彌漫陽性表達(dá),陰性對(duì)照組正常黏膜僅偶見基底層細(xì)胞及固有層淋巴細(xì)胞散在陽性表達(dá)。結(jié)果表明:體外培養(yǎng)的OLP角質(zhì)形成細(xì)胞保持了OLP病損區(qū)的病理表現(xiàn)特點(diǎn)之一即NF-k B的活化。 結(jié)論:選擇臨床診斷和病理診斷一致的Ⅰ型OLP(網(wǎng)狀、斑塊型)標(biāo)本,采取Dispase冷酶消化法獲取細(xì)胞,無血清角化細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)OLP角質(zhì)
8、形成細(xì)胞進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),可傳5~6代。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示,細(xì)胞呈多角形,生長(zhǎng)到一定密度呈現(xiàn)典型的鋪路石狀,符合上皮細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)特征。通過超微結(jié)構(gòu)觀察及角蛋白間接免疫熒光法等細(xì)胞定性研究表明,培養(yǎng)細(xì)胞具有OLP上皮細(xì)胞的典型特征。間接免疫熒光對(duì)核因子k B在口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)和定位的初步測(cè)定表明,此培養(yǎng)體系保持了扁平苔蘚病損區(qū)的部分病理特性,能夠代表此疾病的部分特征,當(dāng)然,為了使OLP角質(zhì)形成細(xì)胞更好的具有疾病模型的代表
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