甲狀旁腺素相關(guān)肽核定位序列與C-末端缺失導(dǎo)致小鼠腦發(fā)育異常.pdf

1、甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)與甲狀旁腺素(PTH)的N-末端在序列及空間構(gòu)象上高度同源并可通過(guò)相同的受體--PTH/PTHrP受體(又稱PTH1型受體)發(fā)揮作用。研究表明PTHrP是一多激素，即不同的結(jié)構(gòu)域具有不同功能。其中間段(37-86)參與胎盤鈣轉(zhuǎn)運(yùn)；C-末端(108-139)具有抑制骨吸收作用。PTHrP(87-107)為核定位序列(NLS)，體外研究表明PTHrP的NLS可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)分泌(intracrine)方式發(fā)揮促進(jìn)細(xì)

2、胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡作用，PTHrP的C-末端對(duì)于NLS入核后的作用發(fā)揮必不可少。但NLS和C-末端的在體功能尚不清楚。為了研究NLS的在體功能，我們通過(guò)在小鼠PTHrP基因第84位氨基酸序列后敲入(Knock-In)一氨基酸翻譯的終止子--TGA，使其只表達(dá)PTHrP(1-84)，而不表達(dá)NLS和C-末端，這樣就產(chǎn)生了PTHrP NLS和C-末端敲除小鼠(即PTHrP KI小鼠，簡(jiǎn)稱KI小鼠)。純合子KI小鼠出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯及肌萎縮、皮膚

3、過(guò)度角化、全身脂肪減少和骨質(zhì)疏松等衰老表型。但是PTHrP KI對(duì)腦發(fā)育的影響尚未研究。 PTHrP及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)且在大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等部位高表達(dá)。為了研究PTHrP KI對(duì)小鼠腦發(fā)育的影響，我們采用胚胎(E18.5)、生后1天(P1)、P7、P14的同窩KI和野生型(WT)小鼠，分別從整體水平、組織細(xì)胞水平和分子水平研究PTHrP的NLS和C-末端缺失導(dǎo)致的小鼠腦發(fā)育異常。整體觀察表明：KI小鼠的腦較輕、吻

4、尾徑縮短、嗅球短小、大腦皮質(zhì)前部較薄、小腦較小。說(shuō)明PTHrP的NLS和C-末端在維持腦正常發(fā)育中起重要作用。通過(guò)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)KI小鼠的室下帶、海馬和小腦中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)都較同窩的WT小鼠明顯減少；Caspase-3免疫組化和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞在KI小鼠齒狀回部位明顯增加；Western Blot結(jié)果表明，KI小鼠的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKI)P16、P21、P27、P53都明顯升高。這

5、些結(jié)果說(shuō)明PTHrP的NLS和C-末端可通過(guò)下調(diào)CDKI表達(dá)而抑制腦細(xì)胞凋亡、刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腦發(fā)育。 神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)免疫組化結(jié)果表明，KI小鼠齒狀回的NeuN陽(yáng)性神經(jīng)元百分率從出生至P14天均較WT小鼠低；在大腦皮質(zhì)，其陽(yáng)性細(xì)胞百分率在E18.5和P1較WT小鼠為低，而從P7至P14，其陽(yáng)性百分率則與WT小鼠相近，但其平均大小則明顯小于同窩WT小鼠。通過(guò)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，P

6、7和P14天的KI小鼠腦干面神經(jīng)核ChAT陽(yáng)性產(chǎn)物總灰度值較WT小鼠明顯降低。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果表明在P1至P14天的KI小鼠腦鈣結(jié)合蛋白D-28k的mRNA水平均較WT小鼠明顯下調(diào)。鈣結(jié)合蛋白D-28k的陽(yáng)性產(chǎn)物面積和總灰度值在P14天的KI小鼠齒狀回、紋狀體和小腦蒲肯野細(xì)胞均明顯降低。這些結(jié)果說(shuō)明PTHrP的NLS和C-末端能夠促進(jìn)神經(jīng)元的分化和成熟，并可通過(guò)上調(diào)鈣結(jié)合蛋白D-28k而促進(jìn)正常神經(jīng)元功能的發(fā)揮并具防止神經(jīng)元

7、退變的作用。 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組化結(jié)果表明，在海馬、小腦和P14天的室下帶部位KI小鼠的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞和纖維與WT小鼠無(wú)明顯差異。但在室下帶部位KI小鼠的GFAP陽(yáng)性結(jié)構(gòu)從E18.5至P7天均較WT小鼠少，并伴有室下帶細(xì)胞向大腦皮質(zhì)遷移的延遲和小腦皮質(zhì)外顆粒層細(xì)胞內(nèi)向顆粒層遷移延遲。髓鞘堿性蛋白(MBP)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KI小鼠MBP陽(yáng)性結(jié)構(gòu)在腦不同部位均較WT小鼠明顯減少。MBP的Western Blot檢測(cè)

8、結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。這些結(jié)果表明PTHrP的NLS和C-末端能夠：①促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在室下帶和小腦的分化，從而加速細(xì)胞從室下帶向大腦皮質(zhì)或從小腦外顆粒層向內(nèi)顆粒層遷移。②促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成。 對(duì)新鮮腦表面血管的觀察發(fā)現(xiàn)P14天的KI小鼠腦血管較WT小鼠明顯細(xì)小。熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(PECAM-1，又稱CD31)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的mRNA水平在P7和P14天KI小

9、鼠均明顯低于WT小鼠。VEGF。的Western Blot結(jié)果與熒光定量RT-PCR結(jié)果一致。這些結(jié)果說(shuō)明PTHrP的NLS和C-末端可通過(guò)促進(jìn)腦血管的發(fā)生而促進(jìn)腦發(fā)育。 本課題對(duì)KI小鼠腦發(fā)育不良進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，包括腦形態(tài)觀測(cè)、腦細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及腦血管發(fā)生檢測(cè)。結(jié)果證明PTHrP KI引起了腦形態(tài)異常、神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力降低和細(xì)胞凋亡增加。這些改變可能與上調(diào)P16、P21、P27和P53等CDKI有關(guān)。PTHr