人乳頭瘤病毒假病毒制備方法的優(yōu)化以及高通量中和實(shí)驗(yàn)檢測系統(tǒng)的建立.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV)能夠引起包括宮頸癌在內(nèi)的多種生殖道疾病，嚴(yán)重危害人類健康。HPV具有嚴(yán)格的宿主特異性和組織分化依賴性，難以通過常規(guī)組織培養(yǎng)方法擴(kuò)增，也難以從病變組織中分離獲得足夠的病毒。因此建立簡便、高效的HPV體外感染模型是發(fā)展HPV預(yù)防疫苗與治療藥物的迫切需要。近來研究發(fā)現(xiàn)HPV假病毒可用于在體外有效模擬HPV的感染，以此基礎(chǔ)建立的中和實(shí)驗(yàn)方法具有較突出準(zhǔn)確、便捷的優(yōu)點(diǎn)，在HPV預(yù)防疫苗、中和抗體研究中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。H

2、PV假病毒中和實(shí)驗(yàn)方法的廣泛使用需要進(jìn)一步提高假病毒構(gòu)建效率，同時(shí)能夠滿足高通量檢測的需要。本實(shí)驗(yàn)室已應(yīng)用磷酸鈣多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法在293FT細(xì)胞中建立了構(gòu)建HPV假病毒的方法，本研究以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對HPV假病毒構(gòu)建體系進(jìn)行系統(tǒng)改進(jìn)和優(yōu)化，建立了更為高效且適合高通量檢測的HPV中和實(shí)驗(yàn)方法。 建立簡便高效、高通量的假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測方法對提高實(shí)驗(yàn)效率，滿足大規(guī)?？贵w檢測的需要具有十分重要的意義。同時(shí)，建立多個(gè)型別的HPV假病毒

3、中和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑榫哂懈弑Ｗo(hù)力的多價(jià)疫苗的開發(fā)提供了全面的中和抗體評價(jià)體系。 本研究首先探討了在HPV假病毒構(gòu)建體系中優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例以及磷酸鈣轉(zhuǎn)染條件對假病毒構(gòu)建效率的影響。結(jié)果顯示，在該體系中不同的HPV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例對于假病毒構(gòu)建效率有顯著影響，HPV主要結(jié)構(gòu)蛋白L1的表達(dá)水平是影響構(gòu)建效率的主要因素，L2表達(dá)質(zhì)粒的用量過高或過低均不利于假病毒的構(gòu)建。報(bào)告質(zhì)粒的用量對假病毒構(gòu)建效率的影響相對較小。綜合比較顯示，在該體

4、系中L1和L2表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒以合適比例(1:1/10:1/2)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染可獲得較理想的構(gòu)建效率。同時(shí)通過優(yōu)化磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑的用量和DNA在磷酸鈣溶液中濃度獲得了較優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件。通過優(yōu)化改進(jìn)，本研究建立了更為高效的HPV假病毒大量制備方法，在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒構(gòu)建中的應(yīng)用結(jié)果顯示相比原方法可顯著提高構(gòu)建效率10～20倍。為HPV假病毒中和實(shí)驗(yàn)的規(guī)模化應(yīng)用提供了有利條件。 為適應(yīng)高通量檢測的需要，

5、本研究通過改進(jìn)報(bào)告基因及檢測方法建立了新型的HPV假病毒中和實(shí)驗(yàn)體系。本研究選擇半乳糖苷酶作為報(bào)告基因，構(gòu)建了攜帶優(yōu)化后的半乳糖苷酶表達(dá)元件的HPV假病毒，研究結(jié)果顯示，假病毒感染后的細(xì)胞加入顯色底物后可呈現(xiàn)顯著的藍(lán)色，并且該標(biāo)記可為酶聯(lián)免疫圖像分析系統(tǒng)(Elispot)所檢測。酶聯(lián)免疫圖像分析系統(tǒng)可對顯色后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行連續(xù)快速的自動(dòng)掃描并計(jì)數(shù)，滿足了高通量檢測的需要。本研究進(jìn)一步對顯色方法進(jìn)行優(yōu)化，提高了檢測效率。通過綜合應(yīng)

6、用優(yōu)化的半乳糖苷酶報(bào)告基因表達(dá)元件與酶聯(lián)免疫圖像分析系統(tǒng)，本研究建立新型的可滿足高通量檢測要求的HPV假病毒中和實(shí)驗(yàn)方法。本研究應(yīng)用該方法對四型HPV中和單抗的鑒定結(jié)果表明，半乳糖苷酶假病毒中和實(shí)驗(yàn)方法與目前應(yīng)用的EGFP假病毒中和實(shí)驗(yàn)方法的檢測靈敏度相當(dāng)，同時(shí)新方法還具有可自動(dòng)連續(xù)檢測、操作簡便、結(jié)果顯示直觀的優(yōu)點(diǎn)，可更好地滿足大規(guī)模中和抗體檢測實(shí)驗(yàn)的需要。本研究應(yīng)用該方法鑒定獲得了2株HPV16中和單抗，3株HPV18中和單抗，以及

7、HPV6和HPV11中和單抗各5株；同時(shí)對本中心生產(chǎn)的HPV16、HPV18、HPV6和HPV11四價(jià)VLP疫苗的抗體保護(hù)性進(jìn)行了評價(jià)，為臨床實(shí)驗(yàn)階段所需疫苗的合適劑量提供了參考。 HPV58和HPV52是中國較為流行的高危HPV型別，但一直以來研究較少。建立HPV58和HPV52假病毒中和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯τ谘芯縃PV58和HPV52以及預(yù)防疫苗的開發(fā)具有重要意義。我們將HPV58和HPV52的衣殼蛋白表達(dá)序列進(jìn)行密碼子人源化優(yōu)化后，