三維骨骼肌組織體外構(gòu)建的初步研究.pdf

1、骨骼肌組織工程的建立為各種骨骼肌病（肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮等）提供了治療希望，也為整形外科治療創(chuàng)傷、腫瘤切除、失神經(jīng)支配所致的肌組織缺失所期盼。盡管組織工程研究已經(jīng)取得顯著的進步，許多人工組織，包括皮膚、骨骼、軟骨已經(jīng)進入臨床，但骨骼肌組織工程研究卻因其在高密度的細胞增殖分化、三維極性培養(yǎng)、較大體積的肌組織構(gòu)建等方面的困難而面臨挑戰(zhàn)。然而，許多學(xué)者仍致力于骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究，試圖創(chuàng)建功能化的肌組織。經(jīng)過多年的探索和努力，一些權(quán)

2、威的研究組取得了相當(dāng)?shù)某煽?，不斷推進骨骼肌組織工程的研究進展：Powell等采用膠原和基質(zhì)成功構(gòu)建三維骨骼肌組織，并對構(gòu)建組織施加機械刺激，確保體外培養(yǎng)肌組織的形成、分化和收縮功能形成；Dennis和Kosnik則探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式，作者稱其構(gòu)建肌組織為Myooids，在橫向電刺激時具有持續(xù)的興奮性和收縮功能。德國的Bach研究組進行了成肌細胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng)，獲得了具有極性分化功能的多核肌管。 骨骼肌

3、組織體外構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)是以成體骨骼肌衛(wèi)星細胞或成肌細胞系為目標(biāo)細胞，體外大量擴增后植入不同的三維基質(zhì)材料，使其生長分化形成具有一定形狀、收縮能力、能較長期存活的體外骨骼肌組織類似物。為實現(xiàn)真正意義的體外骨骼肌組織構(gòu)建，國外學(xué)者在完善肌組織構(gòu)建技術(shù)的同時，也對體外分化并與不同基質(zhì)材料復(fù)合的肌組織中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的表達進行了系統(tǒng)的檢測（如生肌轉(zhuǎn)錄因子、收縮蛋白、肌肉肌酸激酶、乙酰膽堿受體等），多角度探討體外構(gòu)建肌組織的發(fā)生、分化、相應(yīng)特殊轉(zhuǎn)錄

4、因子的表達和控制發(fā)生的信號系統(tǒng)是否與體內(nèi)的骨骼肌成肌細胞的發(fā)生、分化步驟相吻合。 上述骨骼肌組織構(gòu)建和研究的成果，為今后的骨骼肌組織工程研究者提供了線索和思路。我們對國、內(nèi)外有關(guān)骨骼肌組織構(gòu)建研究資料的分析發(fā)現(xiàn)，盡管目前尚難以體外成功構(gòu)建能夠模仿體內(nèi)骨骼肌特性和功能的較大體積的肌組織結(jié)構(gòu)，但現(xiàn)有的、以及正在探索的體外肌組織構(gòu)建物卻能夠模仿體內(nèi)肌組織的分化和發(fā)育，表達收縮蛋白并具備收縮效應(yīng)，且避免了其他細胞或組織成分的干擾，是進行

5、骨骼肌發(fā)生發(fā)育以及骨骼肌肌病研究的理想體外模型。但目前國內(nèi)尚無成功構(gòu)建體外三維肌組織的報道。Sylgard184屬于硅酮橡膠彈性材料，其雙組分混合固化后，表面光滑并具有一定的彈性，具有柔性基底層特征，便于檢測細胞移動和加載產(chǎn)生的牽拉力[6]。因此，作為細胞應(yīng)力拉伸材料，Sylgard184在細胞力學(xué)檢測和骨骼肌組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，學(xué)者們多以此材料為培養(yǎng)基質(zhì)進行骨骼肌組織的體外構(gòu)建[7，8]。 鑒于上述研究背景，本研究考慮以

6、Sylgard184（硅酮彈性材料）作為生長支架，與成肌細胞進行體外復(fù)合培養(yǎng)，探討體外構(gòu)建三維骨骼肌組織模型的可行性。由于支架材料與種子細胞的良好接觸決定細胞的增殖、分化及功能表達，我們首先選用不同的細胞基質(zhì)成分（膠原、層粘連蛋白等）對Sylgard184進行表面包被修飾，分析成肌細胞在不同基質(zhì)材料修飾的Sylgard184表層的生長、分化特性，篩選最佳的表面修飾成分；由于體外構(gòu)建三維肌組織的關(guān)鍵在于極性平行分化肌管的出現(xiàn)及維持，本研究

7、進一步對優(yōu)化修飾的Sylgard184進行壓痕鑄型處理，通過鑄槽的引導(dǎo)作用，以及Matrigel基質(zhì)的促生長和促延展性能，獲取極性平行分化的肌組織，并對極性肌組織的成肌特性、收縮功能進行分析檢測，為成功構(gòu)建三維的體外肌組織模型奠定基礎(chǔ)。 本文內(nèi)容結(jié)構(gòu): 第一章不同基質(zhì)材料修飾的Sylgard184與C2C12細胞的相容性研究。 [目的] 篩選理想的Sylgard184表面修飾的基質(zhì)材料，以提高材料表層與C

8、2C12成肌細胞的生物相容性。 [方法] Sylgard184雙組分以10：1的比例均勻混合，倒入6孔板的其中4孔，室溫下靜置固化，其余2孔做為空白對照培養(yǎng)組（A組）；固化后的Sylgard184表面依次經(jīng)過以下處理：Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）包被（B組）、層粘連蛋白（Laminin）包被（C組）、多聚賴氨酸（poly-lysine）包被（D組）；未經(jīng)包被（E組），每組共6個樣本。利用倒置顯微鏡觀察各組C2C12細

9、胞的生長狀態(tài)，流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測增殖培養(yǎng)48h后C2C12細胞的分裂增殖情況，RT-PCR檢測增殖和分化培養(yǎng)48h后細胞內(nèi)MyoD、Myogenin基因mRNA的表達。 [結(jié)果] Sylgard184材料存在細胞毒性，E組接種的C2C12細胞在24h內(nèi)全部漂浮死亡；D組的大多數(shù)細胞出現(xiàn)死亡，僅少數(shù)貼壁存活；而B、C兩組材料包被后明顯減少Sylagard184的毒性，增強其表面與C2C

10、12細胞的相容性，此外，C組細胞處于合成期的百分比以及MyoD和Myogenin基因mRNA的表達水平均顯著高于A、B二組（P<0.05）。 [結(jié)論] 經(jīng)層粘連蛋白包被修飾的Sylgard184生物相容性最佳，有利于C2C12細胞的生長、增殖及分化。 第二章三維極性分化肌組織的體外構(gòu)建和檢測。 [目的] 利用修飾并鑄型后的Sylgard184與C2C12細胞復(fù)合培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化獲取三維極性分化肌管，

11、檢測分化肌管的生長和功能特性。 [方法] Sylgard184雙組分以10：1的比例均勻混合，倒入6孔板中，室溫下靜置固化，對固化的Sylgard184表面壓痕鑄型（每個小的鑄型凹槽寬0.8mm、深度0.15mm、長度根據(jù)需要可調(diào)整），置生物安全柜，用Hank's液沖洗凹槽，Matrigel和膠原（混合比例1：6）混合液均勻鋪被凹槽底部，每個凹槽加入混合液0.3ml，放置生物安全柜，確保細胞基質(zhì)材料的均勻覆蓋，紫外消毒

12、，接種密度為1.0～1.2×105/ml的C2C12細胞懸液，增殖培養(yǎng)48h后，待細胞增殖約80%融合時撤除全培培養(yǎng)基，加入含2%馬血清的DMEM/F12分化培養(yǎng)7d后，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察攝片，繼續(xù)分化至21d后，對所構(gòu)建的骨骼肌組織進行免疫熒光檢測生肌轉(zhuǎn)錄因子和成肌特異蛋白的表達，RT-PCR方法檢測Myogenin、Desmin基因mRNAs的表達，同時采用掃描電鏡觀察肌管形態(tài)和肌管間的連接。 [結(jié)果] C2C1

13、2細胞在Sylgard184彈性體鑄型壓槽中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化7d后，倒置顯微鏡下觀察可見肌管呈極性分化，肌管之間相互融合；繼續(xù)分化到21d后，對分化形成的肌組織做掃描電鏡檢測，可見肌管之間排列緊密且相互重疊，形成膜樣結(jié)構(gòu)，厚度可達0.15mm，具有三維性；對肌管重疊構(gòu)成的骨骼肌組織進行RT-PCR檢測證實Myogenin、Desmin基因mRNAs的陽性表達，免疫熒光檢測以及DAPI核染，進一步驗證極性肌管內(nèi)分化特異性標(biāo)志蛋白Myogen