脂肪萎縮性糖尿病并下頜骨肢端發(fā)育不全癥樣lamin病的分子病因和胰島素抵抗的分子機(jī)制研究.pdf

1、下頜骨末端發(fā)育不良癥(Mandibuloacral dysplasia,MAD,OMIM 248370)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。由LMNA基因或ZMPSTE24基因突變引起,被歸類于laminopathies。病人表現(xiàn)有出生后生長(zhǎng)遲滯,脫發(fā),下頜骨發(fā)育異常,肢端骨質(zhì)溶解,關(guān)節(jié)僵直,皮膚萎縮及斑點(diǎn)色素沉著等,其中一些臨床癥狀與HGPS相似。此外,病人還常常會(huì)伴有FPLD病人表現(xiàn)出的部分性脂肪營(yíng)養(yǎng)不良和胰島素抵抗。 目的：從

2、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)，探討一例臨床診斷為MAD-likelaminopathies的分子病因和發(fā)病機(jī)制。通過胰島素干預(yù),檢測(cè)患者皮膚成纖維細(xì)胞葡萄糖攝取和葡萄糖氧化以及胰島素信號(hào)通路,探討該例MAD-likelaminopathies的胰島素抵抗的分子機(jī)制。 方法：1.以該例患者皮膚和正常對(duì)照制備人皮膚成纖維細(xì)胞模型；收集詳盡的臨床資料,完成臨床診斷與鑒別診斷。2.基因篩查外周靜脈血提取人類基因組DNA,通過PCR-DNA直接測(cè)序

3、法對(duì)目前明確的可導(dǎo)致核纖層蛋白病的責(zé)任基因進(jìn)行基因篩查。這些基因包括LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPARγ、WRN,篩查包括啟動(dòng)區(qū)域、外顯子區(qū)、外顯子內(nèi)含子相鄰拼接區(qū)。3.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)用Trizol方法，提取患者以及2名對(duì)照皮膚成纖維細(xì)胞中總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增LMNA基因片斷,而檢測(cè)lamin A和la

4、min C基因表達(dá)。4.Northern blot檢測(cè)LMNA基因剪切產(chǎn)物(lamin A/C)mRNA片斷分析比較病例和對(duì)照RNA樣品中l(wèi)amin A和lamin C mRNA的大小和豐度。RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)印跡至尼龍膜等固相支持膜上,再與標(biāo)記的特異性探針雜交,從而分析固定于膜上的mRNA的數(shù)量和大小探針序列選擇lamin A和lamin C的共同序列,探針長(zhǎng)度為450bp。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Sybrgreen

5、染料法,以β-actin為內(nèi)參基因,對(duì)于LMNA、lamin A基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。6.皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)(1) 皮膚成纖維細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)手術(shù)切取患者以及與患者年齡相當(dāng)?shù)?名對(duì)照腹部2～3cm的皮膚,反復(fù)經(jīng)過PBS漂洗后,剪棄脂肪和結(jié)締組織。加入含10％胎牛血清(Gibco BRL)的DMEM中,在37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng),每周換液2次,用0.25％胰酶(內(nèi)含0.02％EDTA)消化傳代。 (2) 皮膚成纖維細(xì)胞

6、的傳代培養(yǎng)當(dāng)培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,用0.25％胰酶(內(nèi)含0.02％EDTA)消化傳代,以1:2或1:4的比例傳代。7.Western blot檢測(cè)laminA/C蛋白表達(dá)。8.細(xì)胞學(xué)形態(tài)觀察和鑒定。9.2-脫氧-D-[1-3H]葡萄糖直接檢測(cè)法觀察病例和對(duì)照的10代,15代,20代皮膚成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激的葡萄糖攝取量。10.D-[U-14C]葡萄糖直接檢測(cè)法觀察病例和對(duì)照的10代,15代,20代皮膚成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島

7、素刺激的葡萄糖氧化情況。11.Western Mot檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵物質(zhì)胰島素受體底物1(IRS1)和胰島素信號(hào)通路P13K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)途徑關(guān)鍵分子P13K的總蛋白表達(dá),基礎(chǔ)和胰島素干預(yù)后蛋白磷酸化的表達(dá)情況；實(shí)驗(yàn)設(shè)一個(gè)無(wú)干預(yù)的陰性對(duì)照,干預(yù)分為長(zhǎng)時(shí)干預(yù)(24小時(shí))和短時(shí)干預(yù)(10分鐘),在細(xì)胞P10進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)和蛋白表達(dá)檢測(cè)。12.以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次得到一致的結(jié)果,

8、每次試驗(yàn)均由不同的人獨(dú)立完成。計(jì)量資料用mean+/-SE表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或ANOVA檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)處理采用statveiw5.0軟件,P<0.05有顯著性差異。 結(jié)果；1.本例患者臨床診斷為MAD-like laminopathy。2.對(duì)LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPARγ、WRN的DNA測(cè)序結(jié)果顯示,LMNA、PPAR7和ZMPSTE24基因中沒有發(fā)現(xiàn)任何變異,INSR和WRN基因的外顯子和內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)一些

9、變異,這些變異是人群中存在的多態(tài)性,在國(guó)外均有報(bào)道。3.在傳代早期(10代前)病例和對(duì)照的細(xì)胞在光鏡下的形態(tài)無(wú)明顯差異,表現(xiàn)為透亮的長(zhǎng)梭狀細(xì)胞,但傳代至10代以后,光鏡下可見病例皮膚成纖維細(xì)胞變得大而扁平,細(xì)胞核增大,細(xì)胞內(nèi)異物增多,生長(zhǎng)飽和密度下降,而對(duì)照的細(xì)胞能一直保持漂亮的長(zhǎng)梭形。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,病例皮膚成纖維細(xì)胞中LMNA與lamin A/C的表達(dá)量與正常人相當(dāng)。結(jié)合DNA測(cè)序、RT-PCR以及northern

10、blot的結(jié)果,病例的LMNA基因在DNA、mRNA水平上沒有發(fā)生明顯變化。5.Western blot檢測(cè)LMNA基因的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)：lamin C的表達(dá)明顯降低,表達(dá)量于對(duì)照相比降低了約94％(P＜0.05),而laminA的表達(dá)與比對(duì)照相比明顯升高。6.對(duì)照成纖維細(xì)胞在傳代過程中保持著長(zhǎng)橢圓形的細(xì)胞核形態(tài)、邊緣光滑,核孔正常分布,異染色質(zhì)在核膜內(nèi)側(cè)呈放射狀分布；電鏡下可見細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生明顯改變。這些核結(jié)構(gòu)缺陷隨傳代逐漸加重。7.為

11、進(jìn)一步觀察本病例的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)與功能的異常,通過直接雙色免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞和形態(tài),lamin A/C的分布情況。對(duì)照成纖維細(xì)胞核呈規(guī)則卵圓形,lamin A/C與emerin在核膜上均勻分布。8.本病例皮膚成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下和胰島素刺激下的葡萄糖攝取量明顯低于2對(duì)照細(xì)胞。9.本病例皮膚成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下和胰島素刺激下的葡萄糖氧化量明顯低于2對(duì)照細(xì)胞。10.患者成纖維細(xì)胞中總IRS1和P13K蛋白表達(dá)均低于對(duì)照,患者P13K基礎(chǔ)酪氨酸磷酸

12、化表達(dá)增加；胰島素作用后對(duì)照的P13K磷酸化水平升高,而患者與基礎(chǔ)狀態(tài)相比,無(wú)明顯變化。 結(jié)論：1.從蛋白質(zhì)水平、亞細(xì)胞水平、細(xì)胞水平及臨床研究，明確了患者M(jìn)AD-like laminopathy的診斷。2.lamin C缺陷與本例MAD-like laminopathy相關(guān),是本例MAD-likelaminopathy的分子病因。3.lamin C蛋白的降解破壞核纖層蛋白層的完整性以及細(xì)胞核的穩(wěn)定性,可能導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié)構(gòu)與功能的