葡萄子原花青素對糖尿病大鼠腎保護機制的分子生物學(xué)研究.pdf

1、研究背景和目的：隨著生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率迅速增高，目前世界糖尿病患者大約1億7千萬人，其并發(fā)癥在全世界范圍內(nèi)急劇增加。在糖尿病各種慢性并發(fā)癥中，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是最主要的血管并發(fā)癥，不僅發(fā)病率高，且最終發(fā)展為終末期。腎衰而致死，死亡率亦高。DN已成為發(fā)達國家終末期腎衰的首位病因，在我國為終末期腎衰第二大病因。據(jù)美國腎臟病資料系統(tǒng)(USRDS)的統(tǒng)計顯示，超過30％的終末期腎功能衰竭為D

2、N所致。DN嚴重威脅人類的生命和健康，已成為世界關(guān)注的重要問題。 DN基本病理特征包括系膜基質(zhì)合成增多，腎小球基底膜增厚，從而引起腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。生長因子和細胞因子的過度表達如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor β 1,TTGF-β 1)，結(jié)締組織生長因子(Connective tissuegrowth factor，CTGF)，生長激素，胰島素樣生長因子和血管內(nèi)皮生長因子在D

3、N發(fā)生和進展中起重要作用。目前認為，TGF-β 1是己知的在DN中致硬化作用最強的細胞因子。腎臟多種實質(zhì)細胞，尤其是系膜細胞合成分泌TGF-β1，并擁有其特異性受體。TGF-β1有自我誘生作用，即在損傷部位釋放的TGF-β1可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生更多的TGF-β1,從而在局部放大了其生物學(xué)作用。TGF-β1可上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter,GLUT)-1，引起細胞內(nèi)糖攝入增加和右旋(D)-葡萄糖增加；增加細胞外基質(zhì)蛋

4、白合成，如膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、纖連蛋白、層連蛋白等，增強細胞表面細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)受體-整合素的表達，使細胞與基質(zhì)黏附增強，促使ECM在腎小球的沉積，促進系膜擴張，基底膜增厚；足細胞凋亡、分離，誘發(fā)基底膜剝脫；刺激足細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子，并抑制ECM降解酶的合成與活性，使ECM降解減少，從而促使腎小球硬化。阻斷TGF-β1活性能抑制ECM的增加和減輕腎臟纖維化。但由于TGF-β1同時具

5、有抗免疫、抗增生效應(yīng)，通過基因敲除的方法長期完全阻斷TGF-β1的作用，動物不能生存。因而人們不得不繼續(xù)探尋其更加特異的作用途徑。CTGF在DN發(fā)病過程中作為TGF-β1的下游調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)TGF-β1的上述作用。體外實驗顯示，CTGF能誘導(dǎo)ECM的合成增加，并且在高糖、機械張力、非酶糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)和TGF-β1下，CTGF在腎臟細胞表達明顯增加。CTGF可以和胰

6、島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、TGF-β1和骨形態(tài)蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)相互作用，并影響上述因子的信號傳導(dǎo)。已有專家提出CTGF可作為DN治療的新靶點。AGEs及其受體在DN的發(fā)病及進展中有很重要的作用。AGEs在半衰期長的蛋白質(zhì)(膠原蛋白、晶體蛋白、彈性蛋白等)及細胞壁上蓄積，使血管壁增厚，彈性降低。當腎小球基底膜增厚時，即使有效糾正高血糖，已被糖化的蛋白質(zhì)也不能恢復(fù)正常。此外，糖

7、化的蛋白質(zhì)與基膜中重要的陰離子蛋白聚糖成分硫酸乙酰肝素的親和力降低，清除增加，一方面損傷基膜的電荷屏障，同時喪失抑制基膜及系膜增生的作用，從而導(dǎo)致基膜和系膜增生。AGEs通過兩種方式發(fā)揮作用：受體依賴性信息交聯(lián)通路和非受體依賴性通路對腎臟造成損害。AGEs與非酶糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end product，RAGE)結(jié)合，可激活第二信號系統(tǒng)，產(chǎn)生大量細胞因子包括TGF-a、血小

8、板源細胞因子、白介素-1等，對腎小球及腎小管間質(zhì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。 目前防治DN的措施包括有效控制血糖，控制系統(tǒng)性高血壓，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，控制血脂障礙等。雖然這些措施可以減緩蛋白尿的增加和腎功能減退，減少死亡率，DN仍然是一個巨大的臨床課題，迫切需要更有效的治療措施。 葡萄子原花青素(Grape seed proanthocyanidin extracts,GSPE)是一類在植物界廣泛存在的具有抗氧

9、化作用的多酚化合物，是一種新型高效抗氧化劑，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑，具有非常強的體內(nèi)活性。其抗自由基氧化能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍。近年來國外研究發(fā)現(xiàn)GSPE有心血管保護作用，它的自由基清除能力可抗心肌缺血再灌注損傷，通過抑制低密度脂蛋白的氧化作用而抗動脈粥樣硬化。針對糖尿病，GSPE可抑制糖尿病大鼠體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)。國內(nèi)外對DN的防治方法多種多樣，但目前為止尚無GSPE預(yù)防及治療DN的深入研究。

10、 本研究擬以糖尿病大鼠為動物模型，從腎臟病理水平，細胞，分子生物學(xué)水平(包括CTGF，TGF-β1，BMP-7，AGEs，RAGE，nephrin,podocin)研究GSPE對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及作用機制，為臨床應(yīng)用GSPE預(yù)防及治療DN提供更深入的理論依據(jù)，為減少DN的發(fā)生，減緩DN的發(fā)展開辟一種嶄新的治療方法。 材料和方法：雄性Wistar大鼠，禁食12小時，尾靜脈注射STZ 55mg/kg(即5.5ml/kg)，7

11、2h后測定血糖，以空腹血糖水平≥16.7mmol/l(300mg/kg)為糖尿病模型成功的標準。實驗分組和處理： (1)正常對照組(C)：取健康雄性Wistar大鼠12只，生理鹽水灌胃。 (2)GSPEE常治療組CT)：取健康雄性Wistar大鼠12只，GSPE 250mg·kg-1·d-1灌胃。 (3)模型組(DM)：糖尿病模型大鼠15只，生理鹽水灌胃。 (4)GSPE小劑量治療組(T1)：糖尿病模型大

12、鼠15只，GSPE250mg·kg-1·d-1灌胃。 (5)GSPE大劑量治療組(T2)：糖尿病模型大鼠15只，GSPE 500mg·kg-1·1-1灌胃。 動物實驗結(jié)束，取血，留尿，取腎組織，檢測血白蛋白(Albumin,Alb)，肌酐(Serum creatinine,Scr：)，AGEs，HDL，LDL，血尿酸(Uric acid,UA)，血糖(fastingplasma glucose，F(xiàn)PG)，糖化血紅蛋白(h

13、emoglobin Alc，HbAlc)，總膽固醇(Cholesterol，CH)，甘油三酯(Triglyceride，TG)，尿查24h尿蛋白總量。腎組織病理檢查包括光鏡PAS染色、Masson染色、電鏡觀察系膜細胞、內(nèi)皮細胞、足細胞超微結(jié)構(gòu)的變化及進行TGF-β1， CTGF，BMP-7，RAGE，nephrin，podocin免疫組化染色。采用RT-PCR技術(shù)檢測TGF-β1，CTGF，BMP-7，RAGE，nephrin,pod

14、ocinmRNA，Western印跡法檢測其蛋白表達。比較各組間差異。 結(jié)果：DM組FPG、HbA1c、血清AGEs、血壓、24h尿蛋白定量、內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)、腎重/體重水平均顯著高于C組(p＜0.01)；DM組ECM蓄積增多，固有細胞超微結(jié)構(gòu)受損；DM組腎組織中TGF-β1，CTGF，RAGEmRNA及蛋白表達水平增加，與C組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)；DM組nephrin，BMP-7mRNA

15、及蛋白水平較C組顯著降低(p＜0.05)。治療組(T1組和T2組)血清AGEs、血壓、24h尿蛋白定量、Ccr、腎重/體重水平較DM組顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，且ECM蓄積減少，固有細胞超微結(jié)構(gòu)受損情況減輕；治療組(T1組和T2組)與DM組相比，腎組織中nephrin，BMP-7mRNA及蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)，TGF-β1、CTGF、RAGEmRNA及蛋白顯著降低(p＜0.05或

16、p＜0.01)。T1組與T2組之間相比，Ccr、腎重/體重和CTGF mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。 結(jié)論：應(yīng)用GSPE干預(yù)DN大鼠，證實GSPE能夠顯著降低糖尿病大鼠蛋白尿、血壓，改善腎小球高濾過狀態(tài)，減輕腎臟ECM蓄積及固有細胞超微結(jié)構(gòu)的損害，對DN具有明確的治療作用。其作用機制與降低血清AGEs、下調(diào)RAGE、TGF-β1、CTGF表達及上調(diào)BWP-7表達有關(guān)；對足細胞有明確的保護作用，可上調(diào)