基及腫瘤細(xì)胞靶向成像的研究于AIE現(xiàn)象發(fā)光機理的納米熒光探針的設(shè)計.pdf

1、第一部分具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性殼聚糖納米顆粒的制備及其活細(xì)胞長程示蹤的研究
　　目的：制備具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)特性的殼聚糖(CS)納米顆粒,評價納米顆粒的理化特性、AIE特性和光穩(wěn)定性以及生物親和性,并探討其在活細(xì)胞長程示蹤標(biāo)記中的應(yīng)用價值。
　　方法：通過酰胺化反應(yīng)將四苯基乙烯衍生物(TPEITC)化學(xué)連接到CS主鏈上生成TPE修飾的殼聚糖(TPE-CS),采用核磁(NMR)、紅外光譜(FTIR)分析檢測TPE的接枝率

2、。經(jīng)離子交聯(lián)法制備負(fù)載TPE分子的CS的納米顆粒(TPE-CSNPs),采用動態(tài)光散射(DLS)測定納米顆粒的水合粒徑、分散性,激光多普勒電泳法檢測納米顆粒的表面電位,透射電鏡(TEM)觀察納米顆粒的直徑和形態(tài)。采用熒光分光光度儀分析TPE-CSNPs的發(fā)光特性和pH值對其的影響。MTT法評價TPE-CSNPs的細(xì)胞毒性。通過不同濃度的TPE-CSNPs進行HeLa細(xì)胞染色以觀察該納米顆粒對細(xì)胞成像的濃度影響,并采用共聚焦激光掃描顯微鏡

3、(CLSM)連續(xù)激發(fā)染色細(xì)胞以計算該納米顆粒的光穩(wěn)定性。TPE-CSNPs入胞機制研究通過疊氮鈉(NaN3)阻斷三磷酸腺苷(ATP)的合成,抑制納米顆粒的進入胞內(nèi),采用CLSM或者流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強度。TPE-CSNPs的出胞作用研究通過標(biāo)記的HeLa細(xì)胞和未標(biāo)記的3T3細(xì)胞共培養(yǎng),在CLSM下觀察納米顆粒的熒光分布情況。經(jīng)TPE-CSNPs標(biāo)記的HeLa細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng),每代觀察一次熒光強度變化,直至細(xì)胞內(nèi)熒光消失,以判

4、斷TPE-CSNPs對細(xì)胞的示蹤時間。
　　結(jié)果：通過TPEITC的異硫氰酸酯基和CS的胺基發(fā)生加成反應(yīng),成功合成了TPE-CS。1HNMR分析顯示CS中不存在的芳香環(huán)的化學(xué)位移峰出現(xiàn)在TPE-CS中,經(jīng)積分面積計算出TPE的接枝率為4.13％。FTIR檢測結(jié)果顯示TPEITC中的NCS在2045cm-1處的特征峰在產(chǎn)物TPE-CS中已消失。通過離子交聯(lián)法成功制備出TPE-CSNPs,DLS檢測顯示納米顆粒的水合粒徑為170nm,

5、分散性好,在TEM下觀察可見納米顆粒成球形、粒徑均一且單分散。PE-CSNPs的表面電位隨著溶液的pH值升高而逐漸降低,但在pH=7.0時仍為正電荷。TPE-CS在酸性溶液(pH2.5)中不發(fā)光,而TPE-CSNPs因TPE分子被固定在CS分子中而發(fā)出強熒光。當(dāng)pH升高至7.0時,兩種的熒光強度均增強,但是TPE-CSNPs的仍強于TPE-CS。細(xì)胞的熒光強度隨著培養(yǎng)基中TPE-CSNPs的濃度增加而增強,且在連續(xù)激發(fā)30min后,細(xì)胞

6、的熒光強度僅下降不到25%。細(xì)胞經(jīng)NaN3預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ATP的合成被阻斷,限制了細(xì)胞的吞噬作用。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比,細(xì)胞的熒光強度較弱。標(biāo)記的HeLa細(xì)胞和未標(biāo)記的3T3細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,CLSM下觀察納米顆粒大部分仍在HeLa細(xì)胞內(nèi),僅有極少量熒光出現(xiàn)在3T3細(xì)胞的區(qū)域。在細(xì)胞長程示蹤研究中,可見隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞內(nèi)的熒光強度呈下降的趨勢,但是染色后第7天仍可見熒光。
　　結(jié)論：TPE-CSNPs呈球形、直徑均一、

7、分散性好且表面帶正電荷,具有典型的AIE特性。TPE-CSNPs的細(xì)胞毒性低,并可通過細(xì)胞吞噬作用進入細(xì)胞內(nèi),且僅少量的納米顆粒經(jīng)出胞作用被排出到胞外,可長時間示蹤活細(xì)胞。因此,TPE-CSNPs有望成為一種長程示蹤活細(xì)胞的納米熒光探針,并可進一步應(yīng)用于監(jiān)測藥物或者基因的負(fù)載和釋放。
　　第二部分生物素化的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的硅膠納米顆粒的制備和生物親和性檢測及其腫瘤靶向成像的研究
　　目的：設(shè)計和制備對生物素受體高表達(dá)的腫瘤

8、細(xì)胞特異性結(jié)合的負(fù)載聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)特性的熒光硅膠納米顆粒(FSNPs)。評估該納米顆粒的理化特性和生物親和性,并檢測其對生物素受體表達(dá)上調(diào)的腫瘤細(xì)胞的靶向成像。
　　方法：通過溶膠-凝膠反應(yīng)制備出負(fù)載噻咯衍生物1的熒光硅膠納米顆粒(FSNP-1),然后在其表面進行胺基化修飾(FSNP-1-NH2)。FSNP-1-NH2表面的胺基與生物素的羧基發(fā)生酰胺化反應(yīng),使生物素化學(xué)結(jié)合在納米顆粒表面(FSNP-1-biotin)。采用

9、紅外光譜儀分析納米顆粒表面的生物素基團,采用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)觀察納米顆粒的直徑及形態(tài),采用X射線光電子能譜(XPS)和能量色譜X射線光譜(EDX)分析納米顆粒的化學(xué)成分,熱重分析(TGA)檢測納米顆粒的熱穩(wěn)定性并計算表面生物素分子的含量。通過細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)等一系列檢測來評價FSNP-1-biotin的生物親和性。以生物素受體低表達(dá)的人正常肝細(xì)胞LO2對照,對生物素受體

10、高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肝癌細(xì)胞BEL-7402進行細(xì)胞成像,觀察進入細(xì)胞內(nèi)的納米顆粒的熒光強度,并行透射電鏡觀察納米顆粒進入細(xì)胞的過程。用FSNP-1-biotin標(biāo)記HeLa細(xì)胞后,觀察其標(biāo)記細(xì)胞的時間并用其示蹤腫瘤細(xì)胞遷移過程。
　　結(jié)果：通過溶膠-凝膠反應(yīng)成功制備出FSNP-1,并通過化學(xué)反應(yīng)修飾了生物素分子。紅外光譜顯示生物素分子的羰基(C=O)出現(xiàn)在FSNP-1-biotin上。TEM和SEM可見FSNP-1-

11、biotin呈球形、粒徑均一且分散性好。XPS和EDX分析顯示生物素分子中的硫元素出現(xiàn)在FSNP-1-biotin中。前體分子1在乙醇溶液中無熒光,而納米顆粒形成后其分子的旋轉(zhuǎn)受到硅膠基質(zhì)的限制,從而發(fā)出強烈的熒光。經(jīng)FSNP-1-biotin處理后的細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)無顯著性改變,僅出現(xiàn)少量多核細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)少量吞噬空泡。CCK-8和臺盼藍(lán)檢測顯示在濃度低于100μg/mL時,與對照組比較,毒性效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而當(dāng)

12、濃度達(dá)到100μg/mL時,對細(xì)胞具有明顯的毒性作用(P<0.05)。FSNP-1-biotin對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平在低濃度(40μg/mL)時無明顯影響(P>0.05),而在高濃度(80μg/mL)時在一定程度上促進細(xì)胞發(fā)生凋亡和提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P<0.05)。FSNP-1-biotin靶向進入生物素受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中,并選擇性標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。這些納米顆粒通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用進入細(xì)胞后,可長時間存留在細(xì)胞內(nèi),在