去迷走治療過(guò)敏性哮喘有效性的神經(jīng)機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘是全球性的嚴(yán)重健康難題，全世界絕大部分國(guó)家的各年齡層的人群均可受到該疾病的不同程度的困擾，而且發(fā)病率逐年增加[1][2]。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不明確。變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)等因素及其相互作用與哮喘的發(fā)病關(guān)系密切。臨床上以內(nèi)科保守治療為主的治療手段不能完全控制哮喘的發(fā)作或徹底的治愈。近年來(lái)的大量研究證明哮喘發(fā)病與支配氣道的植物神經(jīng)失衡密切相關(guān)，其中迷走神經(jīng)為關(guān)鍵因素之一[3]。刺激迷走神經(jīng)引起支氣管收縮，這在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2、中已經(jīng)得到證明，臨床上也觀察到切斷肺門迷走神經(jīng)可使哮喘病人的癥狀得到明顯緩解。但其治療機(jī)制尚未明了，缺乏可靠的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)谇捌谘芯恐谐晒⒘藙?dòng)物的哮喘模型，并通過(guò)手術(shù)實(shí)施雙側(cè)肺門迷走神經(jīng)切斷術(shù)，證實(shí)了該手術(shù)治療方法的可行性及有效性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)卵清蛋白(OVA)致敏大鼠，采用霧化吸入的方法成功制作大鼠過(guò)敏性哮喘模型，并通過(guò)HE染色驗(yàn)證氣道哮喘發(fā)作時(shí)炎性加重及迷走切斷后氣道炎性減輕的情況，驗(yàn)證模型制作成功與否以及治療的有效性

3、。由于氣道平滑肌收縮主要由乙酰膽堿、平滑肌、M受體三者所介導(dǎo)，通過(guò)Karnovsky—Roots法進(jìn)行膽堿能神經(jīng)染色，了解迷走神經(jīng)切斷后膽堿能神經(jīng)的變化；通過(guò)HE染色觀察同一層面平滑肌面積；通過(guò)免疫組化方法了解氣道平滑肌M2、M3受體數(shù)量變化，通過(guò)觀察膽堿能能神經(jīng)周圍嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)和ICAM-1(膽堿能神經(jīng)與嗜酸性粒細(xì)胞粘附致M2失功能的主要因子)的表達(dá)強(qiáng)度，推斷迷走神經(jīng)切斷后膽堿能神經(jīng)與嗜酸性細(xì)胞粘附能力是否減弱。力求從蛋白水平研究

4、雙側(cè)肺門迷走神經(jīng)切斷術(shù)治療哮喘的有效性的機(jī)制。 目的：1.建立過(guò)敏性哮喘和去迷走治療過(guò)敏哮喘有效的動(dòng)物模型。2.從膽堿能神經(jīng)、氣道平滑肌、M受體變化的角度來(lái)探討迷走神經(jīng)切斷治療哮喘有效性的機(jī)制。 方法： 1.模型制作及實(shí)驗(yàn)方法。體重300±21g SPF級(jí)SD雄性健康大鼠40只，隨機(jī)分成4組：A組(致敏哮喘后切斷迷走神經(jīng)組)，B組(致敏哮喘組)，C組(空白組)，D組(單純切斷迷走神經(jīng)組)，每組10只。A、B組采用

5、OVA腹腔連續(xù)注射3天后，1周后采用OVA霧化吸入，誘發(fā)哮喘發(fā)作，持續(xù)霧化一周后，A組從雙側(cè)頸部切斷迷走神經(jīng)，繼續(xù)霧化一周后處死動(dòng)物后取病理學(xué)標(biāo)本(從右葉支氣管開(kāi)口處橫切)；B組行雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)假切斷術(shù)，繼續(xù)霧化吸入一周后在同一解剖位置取病理學(xué)標(biāo)本；C組10只，D1-D3生理鹽水腹腔注射，同步霧化吸入生理鹽水，第14天假切斷雙側(cè)頸部迷走神經(jīng)，第21天取材。D組10只，D1-D3生理鹽水腹腔注射，同步霧化吸入生理鹽水，第14天切斷雙側(cè)頸

6、部迷走神經(jīng)，第21天取材。取大鼠右肺中葉，置于4攝氏度生理鹽水漂洗，沖凈血細(xì)胞等，10％甲醛固定后，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片(膽堿能神經(jīng)染色需活組織冰凍切片)，進(jìn)行免疫組化、HE、膽堿能神經(jīng)染色。使用Nikon顯微鏡攝像系統(tǒng)連續(xù)拍照，采用Image—Pro Plus6.0圖象分析軟件對(duì)表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行掃描并測(cè)出每張切片8個(gè)隨機(jī)視野的IOD值，取其平均值，嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)使用網(wǎng)格法計(jì)數(shù)。 2.檢測(cè)指標(biāo)。(1)鏡下對(duì)4組肺組

7、織HE切片進(jìn)行“肺組織結(jié)構(gòu)、大支氣管周圍淋巴組織、支氣管收縮程度、支氣管周圍炎癥細(xì)胞、血管周圍炎癥細(xì)胞、肺組織炎性細(xì)胞類型、血管擴(kuò)張、呼吸性細(xì)支氣管內(nèi)粘液”進(jìn)行比較。(2)24組支氣管平均直徑的比較。(3)鏡下平滑肌面積(Area)，膽堿能神經(jīng)、M2、M3受體陽(yáng)性表達(dá)的IOD(integrated optical density)累積光密度值。(4)膽堿能能神經(jīng)周圍數(shù)量嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，ICAM-1(膽堿能神經(jīng)與嗜酸性粒細(xì)胞粘附主要因子

8、)的IOD(integrated optical density)累積光密度值。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)為連續(xù)型變量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上采用四組隨機(jī)對(duì)照的方法，數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0處理。四組之間各評(píng)價(jià)指標(biāo)都進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊者使用多組均數(shù)間方差分析，方差不齊者或不符合正態(tài)分布使用多組基于秩次的非參數(shù)檢驗(yàn)。凡涉及均數(shù)結(jié)果以X±S形式給出，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著性。

9、對(duì)于需要進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，對(duì)符合正態(tài)分布的使用pearson相關(guān)，對(duì)不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用spearman相關(guān)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為具有相關(guān)性(r<0.3不顯著相關(guān)0.8>r>0.5輕微相關(guān)r>0.8顯著相關(guān)r為相關(guān)系數(shù))。 結(jié)果：1.鏡下各組病理學(xué)差異見(jiàn)表(1)；A、B、C、D組直徑分別為：444.1±37.4、293.1±30.9、447.7±45.7、452.5±44.0。B組與A、C、D組直徑差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義(P<0.05)，A、C、D三組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.各組氣道同一視野下平滑肌面積，A、B、C、D四組面積(Area)值分別為0.53±0.04；0.54±0.03；0.50±0.09；0.52±0.08。四組平滑肌面積值(Area)總體均數(shù)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3.各組膽堿能神經(jīng)染色的IOD(integrated optical density)累積光密度值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，

11、A、B、C、D各組膽堿能神經(jīng)表達(dá)分別為2.44±0.16、5.16±0.44、1.24±0.61、2.57±0.30(單位為百萬(wàn)象素)，各組IOD值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.各組M2受體免疫組化陽(yáng)性顆粒IOD值。A、B、C、D四組IOD值分別為3.81±0.25；3.29±0.65；1.92±0.24；1.25±0.93(單位為百萬(wàn)象素)，各組IOD值差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5.A、B、C、D四組M3表達(dá)的

12、IOD值秩次分別為28.10，19.70，16.80，17.40，但總體比較各組IOD值差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。6.A、B、C、D四組膽堿能神經(jīng)周圍平均嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為3.8±1.9；10.8±2.3；3.2±2.0；3.1±1.5。其中B組(哮喘組)明顯高于其他組P<0.05，其余三組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。7.A、B、C、D四組ICAM-1的IOD值分別為5.29±0.88；5.98±0.60；4.

13、01±0.57；3.43±0.61。四組陽(yáng)性表達(dá)IOD值總體均數(shù)差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。8.膽堿能神經(jīng)表達(dá)與氣管直徑有負(fù)相關(guān)性：P=0.00 r=—0.66；與M2、M3無(wú)相關(guān)性(P>0.05)．9.膽堿神經(jīng)和EOS、膽堿神經(jīng)和ICAM-1、EOS和ICAM-1有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.619、0.635、0.627。 結(jié)論： 1.成功建立過(guò)敏性哮喘和去迷走治療過(guò)敏性哮喘有效的大鼠模型。 2.迷