血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)分化及其高血壓病的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分、骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究
　　目的:隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞所介導(dǎo)的血管新生已成為心血管再生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitor cells，EPCs)是其中研究最廣泛、最深入的一類干細(xì)胞。骨髓是外周血循環(huán)中EPCs的主要來(lái)源，在一定條件下可得到動(dòng)員并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與到血管的修復(fù)或再生過(guò)程中。
　　EPCs具有多種分化潛

2、能，可以誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。目前，EPCs在自體和異體移植方面都取得了一定程度的成功，EPCs分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞后可修復(fù)血管內(nèi)皮組織，加快損傷的血管再內(nèi)皮化，抑制病理性內(nèi)膜形成，促進(jìn)心肌梗死后新生血管和側(cè)枝循環(huán)的形成，從而從理論上起到改善高血壓和治療心肌梗死的目的。
　　國(guó)外對(duì)于EPCs的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)比較深入，但國(guó)內(nèi)對(duì)EPCs的研究仍處于起步階段。內(nèi)皮祖細(xì)胞主要從骨髓、臍帶血及外周血中獲得，外周血來(lái)源的EPCs因損傷小

3、、易獲取而被廣泛使用，但所獲得的EPCs純度較低。本研究旨在探索一種有效的骨髓源性EPCs的體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化方法，并對(duì)其形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)及功能進(jìn)行鑒定，從而為臨床上進(jìn)行性缺血性疾病的替代治療奠定細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:抽取SD大鼠骨髓細(xì)胞，采用密度梯度離心法提取骨髓液中單個(gè)核細(xì)胞，用含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growthfactor, vEGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(e

4、pidermal growth factor, EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，形態(tài)學(xué)觀察EPCs的生長(zhǎng)分化過(guò)程，對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞采用免疫熒光染色鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，同時(shí)，根據(jù)RT-PCR法檢測(cè)EPCs特異性分子標(biāo)志，并進(jìn)行EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化及檢測(cè)。
　　結(jié)果:培養(yǎng)24h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，4d后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞從集落中央

5、向外周生長(zhǎng)，至培養(yǎng)的第7d成片生長(zhǎng)的細(xì)胞集落相互連接，10d后細(xì)胞形態(tài)明顯改變，由原來(lái)的梭型逐漸縮短、變圓，類似成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，呈現(xiàn)典型的“鵝卵石樣”外觀。貼壁細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果為CD34(+)，CD133(+)，VEGFR-2(+)，F(xiàn)GFR1(+)，陽(yáng)性率分別為（56.23±0.18）％、(87.23±1.66)％、（90.64±0.87）％、(89.78±0.99)％。RT-PCR法檢測(cè)EPCs特異性分子標(biāo)志均為陽(yáng)性表達(dá)。

6、經(jīng)內(nèi)皮誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10天后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榈湫偷涅Z卵石樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光檢測(cè)CD144、CD31陽(yáng)性。
　　結(jié)論:采用密度梯度離心法可獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在培養(yǎng)液中可擴(kuò)增出具有典型特征的EPCs，呈貼壁增殖狀態(tài)，并有分化能力，可在體外誘導(dǎo)分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　第二部分、原發(fā)性高血壓對(duì)循環(huán)中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響作用
　　目的:血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)多來(lái)源于

7、骨髓，在一定條件下可以動(dòng)員到外周血循環(huán)，分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管內(nèi)皮的修復(fù)和新生血管的形成。他汀類藥物能夠通過(guò)提高NO活性來(lái)改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，能夠起到動(dòng)員EPCs的作用。
　　與此相反，大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂紊亂、糖尿病、冠心病等危險(xiǎn)因素可降低循環(huán)內(nèi)EPCs的數(shù)量和功能。而高血壓可以作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損害，同時(shí)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，具有極大的危害性。
　　目前，原發(fā)

8、性高血壓與EPCs的關(guān)系尚未完全研究清楚，本研究旨在探討原發(fā)性高血壓未完全控制狀態(tài)下或理想控制狀態(tài)下，患者外周循環(huán)內(nèi)的EPCs經(jīng)體外培養(yǎng)后在細(xì)胞數(shù)量、粘附能力、增殖能力及細(xì)胞凋亡率等方面是否存在差異。
　　方法:納入60例研究對(duì)象，其中原發(fā)性高血壓患者40例，20例為血壓控制未達(dá)標(biāo)者，另20例為血壓控制達(dá)標(biāo)者，另選取20例在年齡、性別上相匹配的健康成年人為對(duì)照組。所有研究對(duì)象的血糖、血脂、基礎(chǔ)代謝率(BMI)均在正常范圍內(nèi)，且無(wú)靶

9、器官損害情況。從肘正中靜脈采集研究對(duì)象外周血5 ml進(jìn)行EPCs的分離、培養(yǎng)，1周后以乙?；兔芏戎鞍?DiI-acLDL)和荊豆凝集素1（FITC-UEA-1）進(jìn)行雙染色熒光標(biāo)記鑒定，在共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)EPCs數(shù)量;以TUNEL法測(cè)算EPCs的凋亡率，同時(shí)采用MTT比色試驗(yàn)測(cè)定EPCs增殖能力，粘附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的粘附能力。
　　結(jié)果:接種后的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，大小不一，24h后部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，細(xì)胞變大，漸伸展，呈長(zhǎng)梭形;培

10、養(yǎng)72h后貼壁細(xì)胞明顯增多，4～7d細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，核分裂相明顯，貼壁細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形，有的細(xì)胞首尾相連呈條索狀或線狀排列。第9～11天，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板。
　　與正常對(duì)照組比較，血壓控制達(dá)標(biāo)組和血壓控制未達(dá)標(biāo)組患者在EPCs數(shù)量、增殖能力、凋亡率和黏附能力方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;在EPCs數(shù)量、增殖能力和凋亡率等方面，血壓控制未達(dá)標(biāo)組與血壓控制達(dá)標(biāo)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但兩組間的黏附能力比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:原發(fā)性高血壓患者外周血EPCs的數(shù)量減低、功能受損，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)出現(xiàn)障礙;待血壓獲得良好控制后，細(xì)胞數(shù)量和增殖能力均獲得一定程度恢復(fù)，細(xì)胞凋亡率亦降低;故良好的血壓控制，可增加EPCs的修復(fù)能力，最大程度維持對(duì)靶器官的保護(hù)和修復(fù)作用。
　　第三部分、阿托伐他汀對(duì)高血壓患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響
　　目的:內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor c

12、ells，EPCs)廣泛存在于骨髓、臍血、胎肝及外周血等多種組織中，參與缺血組織血管的新生、損傷內(nèi)皮的修復(fù)，抑制血管內(nèi)膜修復(fù)時(shí)的過(guò)度增厚。高血壓作為心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而需要?jiǎng)訂T更多的EPCs來(lái)補(bǔ)充修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮。
　　由于外周血循環(huán)中EPCs具有獨(dú)特的血管內(nèi)皮修復(fù)功能，故與高血壓有關(guān)的外周血EPCs生物學(xué)研究受到越來(lái)越多專家學(xué)者的重視。從外周血中獲取EPCs較骨髓、臍血更方便，且來(lái)源相對(duì)更充

13、足，因此從外周血中分離培養(yǎng)EPCs成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　他汀類藥物除具有降總膽固醇、降低密度脂蛋白膽固醇、延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展、抑制血小板聚集、降低C反應(yīng)蛋白外，還可以改善血管內(nèi)皮功能。已有研究表明，辛伐他汀類藥物有促進(jìn)體外培養(yǎng)的EPCs進(jìn)行增殖的作用，同時(shí)，亦提高祖細(xì)胞的遷移能力，減少凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞趨化活性。本研究通過(guò)分離服用阿托伐他汀的高血壓患者外周血中的EPCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察阿托伐他汀對(duì)高血壓患者EPCs數(shù)量是否

14、有影響。
　　方法:選取原發(fā)性高血壓患者50例，隨機(jī)分為常規(guī)降壓藥物組（常規(guī)組，n=25）和常規(guī)降壓藥物聯(lián)合阿托伐他汀組（實(shí)驗(yàn)組，n=25），另選取10名年齡、性別上相匹配的健康志愿者（對(duì)照組，n=10），所有人員口服阿托伐他汀8周。分別于治療前和治療8周后從受試個(gè)體的肘正中靜脈采集外周血10ml，進(jìn)行EPCs的分離培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)EPCs克隆數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估外周血EPCs水平。
　　結(jié)果:常規(guī)組和實(shí)驗(yàn)組治療8周后

15、收縮壓較前均有顯著降低，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);常規(guī)組收縮壓平均降低（32.2±7.5）mmHg，實(shí)驗(yàn)組平均降低(38.2±7.9) mmHg，組間比較差異具有顯著性(P＜0.05)。對(duì)照組服藥前后收縮壓比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。服藥8周后，常規(guī)組內(nèi)皮祖細(xì)胞克隆形成單位(EPC-CFU)由（7.9±1.7）升高到（11.5±2.1），實(shí)驗(yàn)組EPC-CFU由(8.1±1.9)升高到（12.9±2.5），服藥前

16、后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩組EPC-CFU升高值分別為（3.6±0.6）和（4.9±0.8），具有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)照組治療前后EPC-CFU由（13.8±2.7）升高到(16.1±2.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。該組EPC-CFU平均增加數(shù)為(2.2±0.5)，與實(shí)驗(yàn)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:原發(fā)性高血壓可引起外周血EPCs數(shù)量減低，待血壓降低后EPCs數(shù)量可