ⅠALDH1a2基因影響膀胱癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究Ⅱ腹腔鏡前列腺癌根治術(shù)膀胱尿道吻合單針連續(xù)吻合法的臨床研究.pdf

1、尿路上皮癌(urothelial carcinoma UC)是最常見(jiàn)的泌尿系腫瘤，最新的流行病學(xué)報(bào)告顯示UC 分別占男性和女性惡性腫瘤發(fā)病的第五位和第十位。UC是一個(gè)多因素和多階段的逐漸發(fā)展過(guò)程，涉及到抑癌基因的失活、癌基因的活化、細(xì)胞周期的調(diào)控失常、基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化異常等遺傳學(xué)或表遺傳學(xué)異常等諸多方面。人類基因組有兩類遺傳信息，一類是提供生命必需的蛋白質(zhì)模板信息，稱遺傳學(xué)的信息；而另一類稱表遺傳學(xué)的信息，是指在何時(shí)、何地、以何種方

2、式應(yīng)用上述蛋白質(zhì)模板信息的指令信息。表遺傳學(xué)信息狀態(tài)的確定可為腫瘤的早期診斷及基因治療提供依據(jù)。有研究結(jié)果表明，表遺傳學(xué)改變多發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期，此時(shí)腫瘤細(xì)胞還未對(duì)人體造成實(shí)質(zhì)性損害，如能在此時(shí)進(jìn)行人工干預(yù)，即有可能將腫瘤扼殺在搖籃中。啟動(dòng)子甲基化和組蛋白乙?；潜磉z傳學(xué)修飾最重要的二種機(jī)制。5-氮雜脫氧胞苷(5-aza-dC)是現(xiàn)今最重要的DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)抑制劑之一，而曲古抑菌素A（TSA）則是研究最多的組蛋白去乙酰

3、化酶(HDAC)抑制劑，二者的聯(lián)合使用可以促使腫瘤細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)腫瘤的凋亡。已有研究表明維甲酸（RA）濃度過(guò)低參與了膀胱癌的發(fā)生，使用維甲酸在治療膀胱癌中也取得一定進(jìn)展。而ALDH1a2是催化視黃醛的氧化成維甲酸關(guān)鍵酶之一。有研究證明人類醛脫氫酶家族中ALDH1a2基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化可導(dǎo)致前列腺癌發(fā)病率升高，但在膀胱癌細(xì)胞株中仍無(wú)相關(guān)研究。我們首先對(duì)5 株膀胱癌細(xì)胞株及11例正常膀胱上皮組織的ALDH1a2 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與mR

4、NA，蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性研究后，再采用5-aza-dC、TSA處理膀胱癌細(xì)胞株逆轉(zhuǎn)其甲基化狀態(tài)后，探討對(duì)其影響進(jìn)而誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 目的：探討ALDH1a2基因在膀胱癌細(xì)胞株的甲基化狀態(tài)和表達(dá)及5-aza-dC、TSA對(duì)其影響進(jìn)而誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1. 5-aza-dC 及TSA處理膀胱癌細(xì)胞。
　　 2. 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)五株膀胱癌

5、細(xì)胞株（BIU-87,RT-4,253J,5637,T24）及正常膀胱上皮組織經(jīng)5-aza-dC、TSA處理前后的ALDH1a2啟動(dòng)子甲基化。
　　 3. 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析正常膀胱上皮組織及五株膀胱癌細(xì)胞株經(jīng)5-aza-dC、TSA處理前后ALDH1a2基因mRNA的表達(dá)。
　　 4. 采用Western blot檢測(cè)經(jīng)5-aza-dC、TSA處理前后五株膀胱癌細(xì)胞株及正常膀胱上皮組織ALDH

6、1a2基因蛋白的表達(dá)。
　　 5. 采用AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)記法，檢測(cè)經(jīng)5-aza-dC、TSA處理前后的五株膀胱癌細(xì)胞株的凋亡及壞死。
　　 結(jié)果：
　　 1. 在正常膀胱上皮組織中，ALDH1a2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島表現(xiàn)為低甲基化。在五株膀胱癌細(xì)胞中，ALDH1a2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島均表現(xiàn)為較高的甲基化；TSA不影響ALDH1a2基因DNA 甲基化水平；應(yīng)用5-Aza-dC能使ALDH1a2基因啟動(dòng)子

7、區(qū)CpG 島發(fā)生去甲基化；聯(lián)合給予5-Aza-dC及TSA的作用和單獨(dú)給予5-Aza-dC相似。五株膀胱癌細(xì)胞中，RT-4、253J和5637細(xì)胞與BIU-87,T24細(xì)胞不盡相同，后者啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度更高并且更容易去甲基化。
　　 2.ALDH1a2基因在正常膀胱上皮組織有表達(dá)。在五株膀胱癌細(xì)胞中均無(wú)表達(dá)；經(jīng)TSA作用后也無(wú)表達(dá)；5-Aza-dC作用后，RT-4、253J和5637細(xì)胞中有較弱表達(dá)：吸光度相對(duì)值為0.

8、168，0.146，0.153，均來(lái)源于低分化高度惡性的BIU-87，T24細(xì)胞中有稍強(qiáng)表達(dá)：相對(duì)值為0.342，0.402；聯(lián)合作用后五株細(xì)胞均有較強(qiáng)表達(dá)：相對(duì)值為0.293，0.324，0.421，0.658，0.753，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.ALDH1a2基因蛋白在正常膀胱上皮組織有表達(dá)。在五株膀胱癌細(xì)胞中均無(wú)表達(dá)；經(jīng)TSA作用后，T24細(xì)胞中有少量表達(dá)，其他四株細(xì)胞無(wú)表達(dá)；5-Aza-

9、dC作用后，五株細(xì)胞均有表達(dá)，在T24細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)；聯(lián)合作用后五株細(xì)胞中均有較強(qiáng)表達(dá)。
　　 4.TSA和5-aza-dC 均可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株凋亡，五株膀胱癌細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡及壞死的變化趨勢(shì)稍有不同，前者呈直線上升趨勢(shì)，早期凋亡是膀胱癌細(xì)胞株死亡的主要方式，晚期凋亡/壞死的細(xì)胞相對(duì)較弱。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)濃度下，TSA組和5-aza-dC組誘導(dǎo)凋亡的效果以