桑寄生頑拗性種子生物學(xué)特性及脫水敏感性機(jī)理研究.pdf

1、桑寄生是地位重要但不易繁育的特殊藥材，其種子為典型的頑拗性種子，失活快，脫水敏感性強(qiáng)。而種子作為其唯一的繁殖材料，嚴(yán)重制約其繁育。目前頑拗性種子保存研究多，但成功實(shí)例較少，其根本原因是對脫水敏感性引起的死亡機(jī)理知之甚少，而種子脫水敏感性是引起頑拗性種子死亡的關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　本研究從桑寄生種子生物學(xué)特性、脫水敏感性、低溫保存等方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究，實(shí)現(xiàn)桑寄生種子繁育與保存的目標(biāo);圍繞桑寄生種子脫水過程中細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗氧化系統(tǒng)進(jìn)

2、行綜合研究，篩選脫水敏感性關(guān)鍵時(shí)期的種子進(jìn)行高通量測序，挖掘與脫水敏感性相關(guān)的關(guān)鍵基因，從而揭示桑寄生頑拗性種子脫水敏感性的分子機(jī)理，不僅為研制桑寄生種子的繁育與保存關(guān)鍵技術(shù)提供理論依據(jù)，也為研究其它頑拗性種子提供新的知識與思路。其主要研究結(jié)果如下:
　　(1)影響檢測桑寄生種子生活力的因素的主次為染色時(shí)間＞TTC濃度＞染色溫度，最佳鑒定方法為沿種子長軸的兩側(cè)縱向切開成兩半，在30℃下，將種子至于濃度為0.8％TTC的溶液中黑暗染

3、色8小時(shí)。
　　(2)種子最佳發(fā)芽床是紙床;不同溫度處理種子發(fā)芽率之間差異顯著，最佳發(fā)芽溫度是變溫處理(25/30℃);光照對種子的萌發(fā)無影響;種子不用消毒，用滅菌水處理效果最好;不同批次的種子質(zhì)量有差異，春季采收的種子發(fā)芽率最高。
　　(3)桑寄生種子是典型的頑拗性種子，對低溫極其敏感，長期保存困難，自然狀態(tài)下保存7天后就失去了活力。其最佳的保存方法是:將用無菌水處理過的新鮮種子浸泡到2mg/L的ABA溶液中30min，取

4、出放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用封口袋包裝好置于4℃的冰箱，120天后種子仍有活力。
　　(4)根據(jù)桑寄生種子的萌發(fā)特性，將桑寄生種子的質(zhì)量分為三級，要求純度和凈度都為100％。一級發(fā)芽率不低于75.0％，水分不低于50.0％，百粒重不低于60.0g;二級發(fā)芽率不低于70.0％，水分不低于40％，百粒重不低于50.0g;三級發(fā)芽率不低于60.0％，水分小于40.0％，百粒重低于50.0g。
　　(5)桑寄生最佳的繁殖方

5、法為采集新鮮、飽滿、無病蟲害的果實(shí)去掉果皮，粘于2年生桑樹上部直徑大于1.0cm的枝條之上，早晚灑水，使桑林間空氣濕度保持在80％以上。
　　(6)桑寄生種子對脫水非常敏感，其活力和發(fā)芽率與含水量顯著相關(guān)。新鮮種子的發(fā)芽率為86％（活力為99％），脫水16h后發(fā)芽率迅速下降到39％(活力為66％，含水量為35.17％)，36h后含水量會(huì)下降至24.93％，種子活力變?yōu)?5％，而發(fā)芽率僅為6％，40h種子含水量為23.47％時(shí)，種子

6、基本喪失了活力，只有9％，而發(fā)芽率為0。
　　(7)桑寄生種子脫水過程中細(xì)胞顯微和超微結(jié)構(gòu)變化很大。顯微觀察顯示脫水過程中細(xì)胞間隙逐步增大，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁逐漸分離，從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步降解;超微結(jié)構(gòu)顯示脫水過程中各種細(xì)胞器受到不同程度的損傷，線粒體結(jié)構(gòu)破裂，核膜變得模糊不清，核仁逐步降解，淀粉粒和脂肪體進(jìn)一步分解劣變;脫水過程中生理指標(biāo)變化較大，隨著脫水處理時(shí)間的增加，內(nèi)源激素ABA、ZR、GA、IAA含量總體上呈現(xiàn)先上升再下降的變

7、化趨勢，種子內(nèi)的SOD活性呈總體下降趨勢，超氧陰離子自由基含量、可溶性蛋白和MDA含量則隨種子含水量下降而增加。
　　(8)對不同部位桑寄生總RNA提取方法研究表明，CTAB-LiCl法提取效果最好，TriZol試劑盒法和改良TriZol法均不能有效的去除桑寄生中的多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
　　(9)利用高通量測序技術(shù)，對未脫水的桑寄生種子(CK)，脫水16小時(shí)(Tac-16)和脫水36小時(shí)(Tac-36)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，一共

8、得到386，542，846條高質(zhì)量序列。利用Trinity軟件，組裝得到164，546轉(zhuǎn)錄本（對應(yīng)114，971基因）。通過與NR，UniProt，GO，KEGG pathway和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并對組裝得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了詳細(xì)的注釋。在CK，Tac16和Tac-36樣本中，分別檢測到60，695，56，027和66，389轉(zhuǎn)錄本(＞1FPKM)。通過與CK進(jìn)行比較，在Tac-16中發(fā)現(xiàn)了2，102個(gè)上調(diào)和1，344個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本，

9、而在Tac-36中發(fā)現(xiàn)了1，649個(gè)上調(diào)和2，135個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。這些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本包含一些與已知的脫水過程相關(guān)的基因，比如RD22，熱休克蛋白(HSP)，轉(zhuǎn)錄因子（MYB，WRKY和乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子）。研究結(jié)果顯示HSP和核糖體蛋白(ribosomal proteins)屬于桑寄生頑拗性種子早期響應(yīng)脫水過程的重要基因。原始數(shù)據(jù)已提交到NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(SRA309567)。
　　本研究系統(tǒng)地對桑寄生種子的生物學(xué)特性進(jìn)