中國南海信號芋螺毒素It14a的藥理毒理學(xué)研究.pdf

1、芋螺毒素是生物毒素中迅速發(fā)展的新領(lǐng)域，是很有價值的藥物或藥物先導(dǎo)化合物。本文以中國南海信號芋螺lt14a為研究對象，利用分子生物學(xué)、電生理學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)等方法對這種信號芋螺毒素進(jìn)行了較為系統(tǒng)的藥理毒理學(xué)研究。 實驗室前期的研究中，發(fā)現(xiàn)了新L芋螺毒素基因超家族的lt14a。lt14a是一條具有13個氨基酸、兩對交叉式連接的二硫鍵和一個C末端酰胺化修飾的小肽，其分子量為1391.08道爾頓。通過生物信息學(xué)分析表明，lt14a與α

2、芋螺毒素qc1.1具有前體肽特別是兩者前導(dǎo)肽區(qū)的C末端氨基酸序列上的相似性，但從“C—C—C—C”框架來看，lt14a又和J—超家族類似。實驗初期利用固相合成的信號芋螺毒素lt14a進(jìn)行了小鼠熱板鎮(zhèn)痛實驗顯示有一定的鎮(zhèn)痛活性，通過研究發(fā)現(xiàn)其作用靶點(diǎn)為乙酰膽堿受體。 本論文通過固相化學(xué)合成的方法合成了純度為98.8％的lt14a，圓二色譜分析表明，所合成的信號芋螺毒素的二級結(jié)構(gòu)中不含有β—sheet結(jié)構(gòu)，由α—helix結(jié)構(gòu)和Ra

3、ndom結(jié)構(gòu)組成，其二級結(jié)構(gòu)的組成與J超家族中的p114a二級結(jié)構(gòu)相類似。 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將編碼人源性煙堿型乙酰膽堿受體α3和β4亞基之cDNA，分別重組于真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒（expression plasmid） pcDNA3.1和pcDNA3.0上，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)，把重組后的pcDNA3.0和pcDNA3.1導(dǎo)入HEK293細(xì)胞，使其細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)具有功能的人源性α3β4亞型的煙堿型乙酰膽堿受體。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗（patc

4、h clmap）技術(shù)測量轉(zhuǎn)染細(xì)胞（transfection cells）對It14a的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)It14a在10μM和100μM濃度下對乙酰膽堿（Ach）誘發(fā)的全細(xì)胞電流有一定的抑制作用。在蛙坐骨神經(jīng)（sciatic nerve）—腓腸肌標(biāo)本上檢測It14a體外組織水平活性，100μM濃度的It14a能有效阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，抑制腓腸?。╣astrocnemius）對電刺激神經(jīng)的收縮反應(yīng)（contractile response）。

5、利用膜片鉗技術(shù)，研究It14a對急性分離的SD大鼠背根神經(jīng)細(xì)胞膜中的鈉離子通道和鉀離子通道的電流的影響，記錄結(jié)果顯示100uM的毒素蛋白對這兩種通道的電流沒有任何影響，表明It14a作用的“靶標(biāo)”分子具有較強(qiáng)的專一性，為進(jìn)一步闡明It14a藥理學(xué)屬性奠定了基礎(chǔ)。 運(yùn)用小鼠急性毒性試驗?zāi)Ｐ蛯ζ溥M(jìn)行動物整體水平的毒性研究，對實驗小鼠血液生化指標(biāo)進(jìn)行測定，實驗結(jié)果表明：當(dāng)注射藥物濃度高達(dá)有效鎮(zhèn)痛裁量1400倍時，小鼠血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶