低溫冷凍過程中胞內(nèi)冰晶生長機(jī)制與應(yīng)用研究.pdf

1、低溫造成的直接細(xì)胞損傷，與組織冷凍及復(fù)溫過程中形成的胞內(nèi)冰晶有密切關(guān)系。理解胞內(nèi)冰晶形成與生長機(jī)制，對于腫瘤低溫手術(shù)以及重要細(xì)胞和組織的成功保存有著重要的意義。然而，由于胞內(nèi)冰晶形成和生長的速率太快，傳統(tǒng)成像手段無法捕捉到這一瞬間過程以及胞內(nèi)冰晶的生長細(xì)節(jié)，這阻礙了人們對于胞內(nèi)冰晶形成機(jī)理的認(rèn)識。因此，本論文在傳統(tǒng)低溫顯微技術(shù)中引入了高速 CMOS成像系統(tǒng)，結(jié)合優(yōu)化的成像條件和圖像處理方法，首次成功地觀察到了在貼壁人乳腺癌細(xì)胞系（MCF

2、-7）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC）細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成和生長的清晰結(jié)構(gòu)，并深入比較了在有接種和無接種冰晶條件下，胞內(nèi)冰晶生長和重結(jié)晶現(xiàn)象的不同特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在有接種冰晶條件下，無論是內(nèi)皮細(xì)胞還是乳腺癌細(xì)胞,其胞內(nèi)冰晶總是在較靠近細(xì)胞核的細(xì)胞膜上成核。隨后，冰晶向細(xì)胞核方向生長，在覆蓋整個核內(nèi)空間后再次進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核內(nèi)冰晶生長速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞質(zhì)中。胞內(nèi)冰晶的形態(tài)受降溫速率的影響較大，且在復(fù)溫過程中沒有出現(xiàn)重結(jié)晶現(xiàn)象。而在沒有接種

3、冰晶條件下，胞內(nèi)冰晶出現(xiàn)的溫度范圍要小得多，且枝狀形態(tài)不易辨認(rèn)，受降溫速率影響很小，在復(fù)溫過程中可觀察到重結(jié)晶現(xiàn)象。此外，胞內(nèi)冰晶生長速率更快，并且覆蓋了整個胞內(nèi)空間，而不是像在有接種冰晶條件下，冰晶停止生長在靠近細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)中。這些研究結(jié)果表明細(xì)胞核在胞內(nèi)冰晶的形成與生長過程中有著重要的作用，這對于理解冰晶形成的機(jī)理有著重要的意義。研究結(jié)果還成功解釋了低溫手術(shù)中腫瘤周邊區(qū)域殺傷效果不佳的根本原因，同時也為進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤低溫手術(shù)提

4、供了新的方向。
　　由于胞內(nèi)冰晶形成受到很多因素的影響，通常采用形成概率來預(yù)測其出現(xiàn)的可能性。然而已有的不論是基于現(xiàn)象還是基于機(jī)理的預(yù)測模型，受限于細(xì)胞類型、保護(hù)劑或者溫度范圍等，不能準(zhǔn)確地估算不同細(xì)胞類型內(nèi)的胞內(nèi)冰晶形成概率。為了更準(zhǔn)確地預(yù)測胞內(nèi)冰晶形成概率，我們建立了描述胞內(nèi)冰晶有限擴(kuò)散和生長的新模型。在該模型中，我們同時考慮了同相成核和異向成核機(jī)理。凍存保護(hù)劑的粘滯系數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)則用自由體積模型進(jìn)行估算。在與文獻(xiàn)實驗結(jié)果對比

5、驗證后，該模型被用來計算不同細(xì)胞類型的冷凍保存臨界降溫速率和保護(hù)劑濃度。對于低速降溫保存，我們發(fā)現(xiàn)臨界降溫速率是和細(xì)胞類型相關(guān)的，但受細(xì)胞大小和水分輸送參數(shù)影響較大。而對于玻璃化保存，細(xì)胞類型的影響要大于細(xì)胞大小，特別是受與冰晶成核相關(guān)的熱力學(xué)和動力學(xué)參數(shù)影響非常明顯。該模型進(jìn)而被應(yīng)用于鹿鼠卵母細(xì)胞冷凍過程中的水分輸送和胞內(nèi)冰晶形成現(xiàn)象研究。從估算所得可知，鹿鼠卵母細(xì)胞具有很高的水分輸送活化能，因此對降溫速率的變化非常敏感。同樣，接種冰