中藥組方NDRF聯(lián)合MTX對AA家兔抗炎及免疫調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的：
　?、俑牧技彝米魟┬躁P(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型,為 AA家兔實(shí)驗(yàn)性治療提供良好的動(dòng)物模型;
　　②以中藥 NDRF組方單獨(dú)及聯(lián)合甲氨蝶呤對 AA家兔進(jìn)行干預(yù),觀察其抗炎癥及改善骨關(guān)節(jié)損傷實(shí)驗(yàn)效果,以期對炎癥機(jī)制及抗炎癥治療提供指導(dǎo);
　?、垡灾兴?NDRF組方單獨(dú)及聯(lián)合甲氨蝶呤對 AA家兔進(jìn)行干預(yù),觀察其調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細(xì)胞及Th1/Th2細(xì)胞因子變化,探討免疫耐受在

2、AA致病機(jī)制中的作用。
　　方法：
　?、僖訡FA聯(lián)合TNF-α為誘導(dǎo)劑,第一方案采用10天2次7點(diǎn)注射,第二方案采用14天3次9點(diǎn)注射進(jìn)行改良制備AA家兔模型;
　?、谟^察家兔活動(dòng)、進(jìn)食等一般情況和關(guān)節(jié)腫脹情況,測量體重、體溫及膝關(guān)節(jié)周徑的變化,以關(guān)節(jié)炎指數(shù)作為判定模型標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)增加炎性細(xì)胞因子、病理學(xué)與X影像學(xué)的指標(biāo)觀察;
　?、鄄捎肊LISA法檢測家兔血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-

3、10、TGF-β和滑膜液中MMP-1、MMP-9細(xì)胞因子的水平;
　　④采用 RT-qPCR法檢測家兔滑膜組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA及 MMP-1 mRNA的水平;
　　⑤采用免疫組化法檢測家兔滑膜組織TNF-α、IL-1β的含量變化;
　　⑥家兔關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本用HE染色觀察組織病理變化;
　　⑦DR X線機(jī)對家兔后肢進(jìn)行攝片,以X線影像學(xué)方法觀察家兔骨關(guān)節(jié)變化及評分,判斷骨關(guān)節(jié)的損傷程度

4、;
　?、嗖捎昧魇郊?xì)胞術(shù)檢測家兔外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞的變化。
　　結(jié)果：
　?、俚谝环桨讣彝迷炷?1天時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于6,第二方案家兔造模18天時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于6;右膝關(guān)節(jié)周徑在兩個(gè)方案第一周均增大明顯,與注射前比較,p<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;左膝關(guān)節(jié)周徑第一方案第21天增大明顯,第二方案在第16天增大明顯,分別與注射前比較,p<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、谀Ｐ驮黾又笜?biāo)觀察:家兔造模21

5、天ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著高于造模前;家兔滑膜液中MMP-1、MMP-9含量均顯著高于造模前;滑膜組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)模型組強(qiáng)陽性,正常組為陰性;X線影像正常組與模型組比較,骨侵蝕評分、關(guān)節(jié)間隙評分及骨關(guān)節(jié)間隙測量值均有差異;病理學(xué)觀察模型組家兔皮下組織有明顯紅腫,甚至潰爛,關(guān)節(jié)腔間隙變窄,關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見明顯滑膜腫脹增厚,可見大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞等慢性炎細(xì)胞浸潤。
　　③實(shí)驗(yàn)性

6、治療后家兔 ELISA法細(xì)胞因子檢測結(jié)果:家兔滑膜液中 MMP-1、MMP-9中藥NDRF組與聯(lián)合治療組下降明顯,與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;實(shí)驗(yàn)性治療后家兔血清 IL-10、TGF-β、IL-4含量不同程度升高,中藥組升高明顯,與模型組比較p<0.05有差異。實(shí)驗(yàn)性治療后家兔血清IFN-γ含量下降,中藥組下降明顯,與模型組比較p<0.05有差異。
　　④實(shí)驗(yàn)性治療后家兔滑膜組織TNF-αmRNA、IL-1βmRNA及

7、MMP-1 mRNA相對定量統(tǒng)計(jì)分析mRNA(2-(??Ct)值):TNF-αmRNA結(jié)果中藥NDRF組和聯(lián)合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異;IL-1βmRNA結(jié)果中藥NDRF組和聯(lián)合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異;MMP-1 mRNA結(jié)果中藥NDRF組和聯(lián)合組比模型組均明顯降低,p<0.05有顯著性差異。
　?、輰?shí)驗(yàn)性治療后家兔膝關(guān)節(jié) X線影像學(xué)觀察:造模組骨侵蝕評分與骨關(guān)節(jié)間隙評分明顯升高,關(guān)節(jié)

8、間隙縮小。治療后各治療組均有不同程度恢復(fù),骨侵蝕評分中藥組、聯(lián)合組分別與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,骨關(guān)節(jié)間隙評分聯(lián)合組與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;骨關(guān)節(jié)間隙測量中藥組、聯(lián)合組分別與模型組比較,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　⑥實(shí)驗(yàn)性治療后家免疫組化結(jié)果:聯(lián)合組家兔關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度與模型組比較明顯降低,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中藥組家兔關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、I

9、L-1β的表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度與模型組比較有所降低,但表達(dá)水平與模型組比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p>0.05無差異,表達(dá)強(qiáng)度與模型組比較,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?、逿細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果:模型組家兔外周血 CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分率明顯低于正常對照組,兩組比較p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;治療后中藥NDRF百分率升高,與模型組比較p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　?、俦緦?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浣Y(jié)果:CFA聯(lián)

10、合TNF-α為誘導(dǎo)劑,第一方案采用10天分2次7點(diǎn)注射,結(jié)果成模率78％,21天關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于6;第二方案采用14天分3次9點(diǎn)注射,結(jié)果成模率83%,18天關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于6;AA家兔模型增加炎性細(xì)胞因子含量、病理學(xué)改變及膝關(guān)節(jié)X線影像學(xué)改變情況觀察,結(jié)果均有異常,表明AA模型成功。
　　②本研究實(shí)驗(yàn)性治療結(jié)果,中藥 NDRF及聯(lián)合 MTX可降低 AA家兔滑膜液MMP-1、MMP-9細(xì)胞因子水平;中藥NDRF及聯(lián)合MTX可降低AA家

11、兔滑膜組織TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、MMP-1m RNA水平;通過下調(diào)TNF-α、IL-1β、MMP-1、MMP-9水平,發(fā)揮抑制致炎效應(yīng)和改善骨關(guān)節(jié)的損傷。
　　③本研究對實(shí)驗(yàn)性治療家兔進(jìn)行X線影像學(xué)觀察,結(jié)果X片顯示中藥NDRF及聯(lián)合MTX治療后家兔膝關(guān)節(jié)界限清晰,關(guān)節(jié)面較光滑,關(guān)節(jié)間隙狹窄有一定程度改善,病變程度有所減輕,經(jīng)骨侵蝕評分、骨關(guān)節(jié)間隙評分和關(guān)節(jié)間隙測量,結(jié)果治療組均較模型組好,值得深入研究。