軸突導(dǎo)向分子EphA5誘導(dǎo)中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞向紋狀體投射的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease)是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)遇行性疾病，該病的主要病理學(xué)特征是中腦內(nèi)多巴胺能（Dopaminergic，DA）神經(jīng)元的選擇性退變，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量降低，紋狀體的神經(jīng)元失去了多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，從而引起震顫麻痹等錐體外系運(yùn)動(dòng)障礙。隨著我國(guó)老齡社會(huì)的來(lái)臨，該病的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，并給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，探求帕金森病的致病機(jī)制進(jìn)而尋找有效治療辦法是社會(huì)的迫切需求。<

2、br>　　 研究帕金森病的核心問(wèn)題就是闡明該病的發(fā)病機(jī)理，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)性防治。多年的研究表明，遺傳及環(huán)境多種因素均與帕金森病有關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了遺傳因素學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)及鐵代謝學(xué)說(shuō)等，上述不同致病因素均是引發(fā)中腦多巴胺能神經(jīng)元的選擇性退變而導(dǎo)致帕金森病的。中腦多巴胺神經(jīng)元及其向紋狀體靶向投射的異常是導(dǎo)致帕金森病的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)，也是研究帕金森病最本質(zhì)的問(wèn)題。
　　 新近有研究指出，軸突導(dǎo)向分子EphA5可能與中腦DA神經(jīng)元

3、軸突的靶向生長(zhǎng)相關(guān)；免疫組織化學(xué)染色也顯示，中腦DA神經(jīng)元大都同時(shí)表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)和EphA5。作為軸突導(dǎo)向分子的EphA5與紋狀體細(xì)胞表達(dá)的EphA5配體的結(jié)合可能是DA神經(jīng)元軸突向紋狀體生長(zhǎng)的重要機(jī)制?；谶@種理念，我們?cè)O(shè)計(jì)了這一實(shí)驗(yàn)：
　　 (1)以中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、RT-PCR及Western-blot等技術(shù)方法檢測(cè)了EphA5在中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞中的表達(dá)狀況和其配體Ephrin

4、-A5在紋狀體中的表達(dá)狀況；
　　 (2)為進(jìn)一步檢測(cè)EphA5是否引導(dǎo)了中腦DA神經(jīng)元軸突向紋狀體的投射，我們?cè)谛律竽X紋狀體部注入綠色熒光示蹤劑，逆行標(biāo)記了中腦中向紋狀體投射的那部分DA神經(jīng)元；同時(shí)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)了中腦中綠色熒光陽(yáng)性神經(jīng)元同時(shí)表達(dá)EphA5的狀況，以明確這些逆行標(biāo)記的陽(yáng)性DA神經(jīng)元就是EphA5陽(yáng)性細(xì)胞；
　　 (3)將取自GFP轉(zhuǎn)基因鼠的中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞與普通鼠的紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)，觀

5、察了細(xì)胞向紋狀體的靶向生長(zhǎng)情況；并檢測(cè)了紋狀體提取液對(duì)中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞軸突生長(zhǎng)的作用；
　　 (4)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，沉默基因EphA5的表達(dá)，觀察干擾后的中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)情況。
　　 (1)取自胚胎中腦的神經(jīng)上皮干細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁并發(fā)出短的突起；48h后，免疫熒光染色顯示，絕大多數(shù)細(xì)胞呈TH陽(yáng)性，其中部分細(xì)胞呈EphA5陽(yáng)性；
　　 (2)鼠腦紋狀體區(qū)EphA5免疫熒光染色顯示，紋狀

6、體部的大多數(shù)細(xì)胞呈Ephrin-A5陽(yáng)性，說(shuō)明這些細(xì)胞是產(chǎn)生EphA5配體的細(xì)胞；
　　 (3)RT-PCR及Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，紋狀體組織Ephrin-A5mRNA及蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組前額葉皮質(zhì)，結(jié)果有顯著性差異(P<0.01)；進(jìn)一步證明了EphA5的配體來(lái)自絞狀體細(xì)胞；
　　 (4)紋狀體綠色熒光逆行示蹤和TH、EphA5免疫熒光染色結(jié)果顯示，熒光標(biāo)記的神經(jīng)元大部呈TH陽(yáng)性，部分呈

7、EphA5陽(yáng)性，說(shuō)明DA神經(jīng)元大部分投射至紋狀體，其中部分細(xì)胞表達(dá)EphA5;
　　 (5)將中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞與紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示，培養(yǎng)l2h后，有些細(xì)胞在靠近紋狀體組織塊一側(cè)出現(xiàn)丘狀隆起；24h后，細(xì)胞伸出短突起：48h后，突起增多伸長(zhǎng)；培養(yǎng)3d后，可見(jiàn)細(xì)胞在靠近紋狀體的一側(cè)伸出長(zhǎng)的線(xiàn)性突起而在其它方向突起短。應(yīng)用取自GFP轉(zhuǎn)基因鼠的中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞與普通鼠的紋狀體組織塊共培養(yǎng)，朝向紋狀體組織塊生長(zhǎng)的突起數(shù)目及

8、長(zhǎng)度明顯大于背向生長(zhǎng)情況（P　　 (6) RNA干擾后的中腦神經(jīng)上皮干細(xì)胞與紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果顯示，突起向紋狀體匯集的趨勢(shì)不明顯，朝向和背向紋狀體組織塊伸出的突起數(shù)目、長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 本項(xiàng)研究表明，中