化學發(fā)光酶免疫分析法測定磺胺對甲氧嘧啶.pdf

1、本課題是將化學發(fā)光技術(shù)與免疫學技術(shù)相結(jié)合,即化學發(fā)光酶免疫分析法來定量測定抗生素藥磺胺對甲氧嘧啶在食品中的殘留。采用競爭法,即將待測樣品中的磺胺對甲氧嘧啶與一定量的標記有辣根過氧化物酶的磺胺對甲氧嘧啶(或標記有堿性磷酸酶的磺胺對甲氧嘧啶)競爭性地與固相磺胺對甲氧嘧啶抗體進行結(jié)合,通過分離未結(jié)合的標記抗原,測定標記抗原與抗體復合物化學發(fā)光強度,經(jīng)相應(yīng)的數(shù)學函數(shù)計算出待測抗原的含量。根據(jù)這一基本原理,分別利用魯米諾體系和金剛烷類體系作為化學

2、發(fā)光底物,快速地測定食品中的磺胺對甲氧嘧啶殘留量。
　　 本課題主要是從以下幾個方面進行研究:
　　 1辣根過氧化物酶-魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系的研究
　　 1.1首先是選擇一種理想的方法將酶標記在藥物小分子上,經(jīng)篩選得出用重氮化偶聯(lián)法能較好地進行辣根過氧化物酶的標記,并用以下三種方法來鑒定標記復合物:首先是偶聯(lián)物的顏色變?yōu)樽霞t色；其次,從紫外圖譜可以看出偶聯(lián)物在233nm處有一特征吸收峰且有位移；最后,從偶聯(lián)物

3、紅外光譜圖中可以看出:在3500～4000cm-1區(qū)域,2250～2500 cm-1區(qū)域及1250～1750 cm-1區(qū)域有辣根過氧化物酶中氨基酸的特征峰,在900～1160 cm-1區(qū)域又有磺胺對甲氧嘧啶的特征峰。
　　 1.2其次優(yōu)化實驗條件,最佳條件為:抗體包被濃度為2.5μg/ml,酶標記物工作液稀釋度為1:4,每孔加待測樣品或標準品50μl和酶標記物50μl,在37℃下反應(yīng)1h,洗滌后每孔加發(fā)光底物100μl,避光反應(yīng)

4、1.5min后在發(fā)光檢測儀下檢測發(fā)光計數(shù)。
　　 該方法學檢測限為3.2pg/ml,批內(nèi)相對標準偏差小于13％,批間相對標準偏差小于18％。標準曲線回歸方程為y=-0.0063x+6.6846(x是標準樣品濃度的對數(shù),y是發(fā)光強度的對數(shù)),線性范圍為10～2000pg/ml,相關(guān)系數(shù)為0.9952。
　　 2堿性磷酸酶-金剛烷類發(fā)光體系的研究
　　 2.1首先同樣是選擇一種理想的方法將酶標記在藥物小分子上,經(jīng)篩選

5、得出用重氮化偶聯(lián)法能較好標記堿性磷酸酶,并用三種方法來鑒定標記復合物:首先是偶聯(lián)物的顏色變?yōu)樽霞t色；其次,從紫外圖譜中可知偶聯(lián)物在238nm處有一特征吸收峰且有位移；最后,從偶聯(lián)物紅外光譜圖中可以看出:在3500～4000cm-1區(qū)域,2250～2500 cm-1區(qū)域及1250～1750 cm-1區(qū)域有堿性磷酸酶中氨基酸的特征峰,在800～1200 cm-1區(qū)域又有磺胺對甲氧嘧啶的特征峰。
　　 2.2其次優(yōu)化實驗條件,最佳條件

6、為:抗體包被濃度為5.0μg/ml,酶標記物工作液稀釋度為1:10,每孔加待測樣品或標準品50μl和酶標記物50μl,在37℃下反應(yīng)1h,洗滌后每孔加發(fā)光底物100μl,避光反應(yīng)25min后在發(fā)光檢測儀下檢測發(fā)光計數(shù)。
　　 該方法學檢測限為28.0pg/ml,批內(nèi)相對標準偏差小于15％,批間相對標準偏差小于18％。標準曲線回歸方程為y=-0.0215x+5.1726(x是標準樣品濃度的對數(shù),y是發(fā)光強度的對數(shù)),線性范圍為50

7、～10000pg/ml,相關(guān)系數(shù)為0.9961。
　　 3對實際樣品進行檢測
　　 3.1用建立起來的辣根過氧化物酶-魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系對牛奶、雞蛋、蜂蜜和血漿中磺胺對甲氧嘧啶的含量進行檢測,回收率分別為:91.0‰～104.0％、84.0％～92.0％、90.0％～113.0％、110.0％～119.0％,符合要求。
　　 3.2將化學發(fā)光酶免疫分析與酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法進行比較,得知前者的檢測