Alzheimer病患者同型半胱氨酸水平及AD與腫瘤壞死因子308G-A、238G-A基因多態(tài)性的關系.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進行性退行性疾病。臨床表現(xiàn)為進行性記憶和認知障礙、言語障礙、精神運動異常等，主要病理改變是老年斑(senile plaque,SP)，神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillaiy tangle,NFT)及神經(jīng)元空泡樣變等。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一種含硫氨基酸，由蛋氨酸去甲基產(chǎn)生。Hcy可在亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenete

2、trahydrofolatereductase，MTHFR)、蛋氨酸合成酶(methionine synthase,MS)的催化下，以葉酸、VitB12為輔酶再甲基化為蛋氨酸。血漿Hcy水平同時受環(huán)境因素和遺傳的影響。葉酸、VitB12缺乏與血漿Hcy水平升高有關。目前的大量研究顯示，高Hcy血癥是心腦血管疾病的獨立危險因素。1998年Clarke提出高Hcy血癥與阿爾茨海默病相關，隨后，國外有研究認為高Hcy血癥是心腦血管疾病的獨立危

3、險因素，但目前存在很大爭議。隨著免疫學和分子生物學的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)AD腦中存在著大量炎性因子如IL-1、IL6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、趨化因子、轉(zhuǎn)化生長因子以及補體等，這些因子是由激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的，通過刺激這些細胞的活性，發(fā)生局部的免疫反應而增加β淀粉樣肽的產(chǎn)生。TNF-α基因位于染色體6p21.3，全長約為3kb,由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，廣泛參

4、與免疫系統(tǒng)的發(fā)育、炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)等。TNF-α具有雙重、多樣及網(wǎng)絡性生物效應.不僅參與維持正常生理功能.還可在多種病理過程中異常表達并具重要作用。有研究證實TNF-α基因啟動子區(qū)域-238G/A、-308位點存在多態(tài)性，這種基因多態(tài)性的存在可能影響TNF基因轉(zhuǎn)錄和表達，進而影響TNF的生物學功能。實驗動物及人體研究表明TNF參與調(diào)控正常和異常的腦發(fā)育，因此，深入了解炎性因子TNF及其遺傳多態(tài)性在AD慢性炎癥病理改變中作用，對進一步闡

5、明AD的分子及遺傳發(fā)病機制并指導治療有重要意義。本文旨在通過了解AD患者血漿Hcy水平及給予AD患者服用葉酸、VitB12，探討葉酸、VitB12對AD患者血漿Hcy水平的影響；利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測對AD和對照者的TNFα-238G/A、-308 G/A基因和血清TNF水平進行檢測，初步探討TNFα-238G/A、-308G/A基因多態(tài)性及其與Alzheimer病的關系。
　　 第一部分、維生素干預治療對Alzh

6、eimer病患者血漿同型半胱氨酸水平的影響
　　 材料與方法：
　　 1.研究對象：所有研究對象為2005年1月～2006年8月廣州市老人院癡呆病區(qū)及廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的AD患者，為漢族人，年齡≥60歲，各研究對象無血緣關系。AD組75例，符合美國神經(jīng)病學、語言障礙和卒中—老年性癡呆和相關疾病學會(NINCDS—ADRDA)診斷AD標準中“很可能AD"，根據(jù)臨床癡呆量表(clinical dementia

7、 rating scale,CDR)評分分組，分為輕中度AD和重度AD；對照組71例，無癡呆及神經(jīng)系統(tǒng)變性病，性別、年齡、合并癥與AD組相匹配。所有研究對象4月內(nèi)無腦梗塞及心肌梗死發(fā)作，均除外惡性腫瘤、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、嚴重營養(yǎng)不良等疾病及排除近1個月內(nèi)服用影響Hcy水平的藥物(如：避孕藥、抗癲癇藥物、多巴胺類藥物、葉酸、VitB12等)者。
　　 2.收集血標本：抽取研究對象清晨空腹靜脈血3ml，置于含有2％乙二胺四乙

8、酸二鈉(EDTA)100μl的一次性試管中，保存于4℃冰箱，1h內(nèi)離心(3000rpm，10min)，分離出血細胞、血漿，-20℃冰箱保存。
　　 3.血漿Hcy、葉酸、VitB12濃度測定：取-20℃冰箱保存血漿，用熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunassay，F(xiàn)PIA)檢測血漿Hcy濃度，用微粒子酶免分析法(microparticle enzyme immunoassay，ME

9、LA)測定血漿葉酸、VitB12濃度。
　　 3.葉酸、VitB12干預治療：隨機選取32例AD接受8周維生素干預治療，給予口服葉酸5mg及VitB12500,每日1次，在治療4周、8周時復查血漿Hcy、葉酸、VitB12濃度。
　　 4.統(tǒng)計學分析：所獲的計數(shù)指標用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，以P＜0.05為判斷差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.AD組和對照組血漿Hcy、葉酸、VitB12水

10、平比較
　　 AD組血漿Hcy水平顯著高于對照組(P＜0.001)，血漿葉酸、VitB12顯著低于對照組(均P＜0.001)。相關分析顯示：AD患者血漿Hcy、葉酸、VitB12水平呈負相關(r1=-0.237，P=0.041,r2=-0.356，P=0.002)。
　　 2.重度AD患者血漿Hcy水平明顯高于輕中度AD患者(P＜0.05)，血漿葉酸水平低于輕中度AD患者(P＜0.05)。
　　 3.葉酸、Vit

11、B12干預治療對AD患者血漿Hcy濃度的影響
　　 32例AD患者接受了葉酸、VitB12干預治療，結果發(fā)現(xiàn)：血漿Hcy水平下降與治療時間相關，服用維生素干預治療8周后，血漿Hcy明顯下降(t=11.601,P＜0.001)；葉酸和VitB12則顯著升高(t1=-10.46，P＜0.001；t2=-5.352，P＜0.001)。
　　 結論：
　　 1.AD患者存在血漿Hcy水平升高及葉酸、VitB12水平降低，

12、AD患者血漿Hcy水平與葉酸、VitB12水平呈負相關。
　　 2.AD患者血漿Hcy水平與癡呆程度相關，癡呆程度越嚴重，血漿Hcy水平越高。
　　 3.口服常規(guī)劑量葉酸、VitB12可明顯降低AD患者血漿Hcy水平。
　　 第二部分、Alzheimer病患者與腫瘤壞死因子308G/A、238G/A基因多態(tài)性的關系
　　 材料與方法：
　　 1.研究對象：均為2006年7月-2007年10月廣州市

13、老人院AD病人，與廣東地區(qū)漢族人飲食結構相似，各研究對象之間無血緣關系，兩組間性別和年齡差異無顯著意義。AD組66例，男34例，女32例，平均年齡(75.462±9.125)歲。全部病例應用簡易精神狀態(tài)檢查量表(mini-mental state examination，MMSE)日常生活活動能力量表(activities ofdaily living,ADL)初篩出存在癡呆，Hachinski缺血指數(shù)分＜4分排除缺血性癡呆，哈密爾頓抑

14、郁量表(HAMD)評分＜8分排除抑郁狀態(tài)。根據(jù)美國神經(jīng)病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關疾病學會NINCDS-ADRDA的臨床診斷標準診斷為臨床很可能AD。對照組143例，男75例，女68例，平均年齡(72.259±8.014)歲。全部為生活在廣州老人院的智能正常老年人，納入標準：(1)無嚴重腦血管病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(2)簡易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)分值均高于與文化程度相對應的分界值。
　　 2.人外周血白細胞DNA

15、的提?。红o脈血2ml，EDTA抗凝，采用美國Gentra公司的DNA抽提試劑盒，抽提基因組DNA。
　　 3.TNFα-308 G/A基因多態(tài)性的檢測：參照文獻設計引物，PCR擴增TNFα-308G/A基因后的產(chǎn)物長度為116bp，產(chǎn)物用NcoI限制性內(nèi)切酶酶切，用3.5％瓊脂糖凝膠電泳后，觀察酶切后的產(chǎn)物長度。
　　 4.TNFα-238G/A基因多態(tài)性的檢測：參照文獻設計引物，PCR擴增TNFα-238G/A基因后的

16、產(chǎn)物長度為152bp，產(chǎn)物用MspⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，用3％的瓊脂糖凝膠電泳后，觀察酶切后的產(chǎn)物長度。
　　 5.血漿TNF水平測定：取靜脈血2ml，注入含10％依地酸二納(EDTA)30μl，在4℃下離心10 min，取血漿置-20℃保存至同批測定。酶免法測量血漿TNFα水平。
　　 6.統(tǒng)計學分析：用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，計算上述基因的基因突變率、等位基因頻率、基因型頻率、基因多態(tài)性與疾病的相關性及相對危

17、險度。計量資料組間比較用獨立樣本t檢驗、配對t檢驗和單因素方差分析，計數(shù)資料組間比較用x2檢驗?；蛐图暗任换蛳鄬︼L險率比數(shù)比(Odds Ratios，OR)以及95％可信區(qū)間表示，顯著水平用x2檢驗，及Logistic回歸分析確定獨立危險因素。
　　 結果：
　　 1.血漿中TNF水平，AD組明顯高于對照組，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.AD組與對照組之間TNFα-308G→A突變差異無統(tǒng)計學意義

18、;AD與對照組TNFα-308G→A基因三種基因型攜帶者組間血漿TNF水平比較差異也無統(tǒng)計學意義。
　　 3.AD組與正常對照組之間TNFα-238G/A突變差異無統(tǒng)計學意義；AD與對照組TNFα-238G/A基因三種基因型攜帶者組間血漿TNF水平比較差異也無統(tǒng)計學意義。
　　 4.TNFα-308G/A和TNFα-238G/A的復合基因型在AD和對照組之間無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 AD組血清T