三峽庫區(qū)土壤來源真菌SXW-05的分離鑒定及其活性產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、研究背景：近年來，隨著各種抗生素的廣泛應(yīng)用，病原微生物的耐藥問題日趨嚴(yán)重，尋找新型有效抗生素刻不容緩；抗腫瘤藥物雖種類繁多，但其毒副作用、高昂成本也迫使人們?nèi)ふ倚滦陀行Э鼓[瘤藥物，因此國內(nèi)外科研工作者正從天然產(chǎn)物中積極探索、尋找活性先導(dǎo)化合物。真菌特有的遺傳背景和生物合成途徑，使其次級代謝產(chǎn)物極為豐富，成為篩選新型抗菌藥物的和抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物的重要來源。自第一個廣譜抗生素一青霉素問世以來，從真菌中尋找具有生物活性、結(jié)構(gòu)新穎的次級代

2、謝產(chǎn)物的研究長期受到生物醫(yī)藥工作者的重視。
　　 三峽庫區(qū)地處四川盆地與長江中下游平原的交界處，巫山地處三峽庫區(qū)腹心，屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，雨量充沛，獨特的喀斯特地貌和明顯的立體氣候特征使巫山地區(qū)土壤蘊藏著豐富的微生物資源，各種微生物可能因環(huán)境的特殊而代謝多種活性次級代謝產(chǎn)物，成為新藥篩選中重要的先導(dǎo)化合物來源。
　　 研究目的：本文從三峽庫區(qū)巫山土壤樣品中分離培養(yǎng)真菌，經(jīng)過抗菌活性、抗癌活性篩選后，選擇活性抗菌譜廣、

3、活性較強的菌株作為研究對象，對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，以獲得活性產(chǎn)物，尋找先導(dǎo)化合物，豐富三峽庫區(qū)天然藥用先導(dǎo)化合物的來源。
　　 研究方法：本文對采集的土壤樣品進(jìn)行處理后，利用平板稀釋法進(jìn)行真菌的分離培養(yǎng)；對所得到的真菌菌株采用牛津杯雙層平板法和MTT法，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、藤黃八疊球菌(

4、Sarcina lutea)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為受試細(xì)菌，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為受試細(xì)胞，進(jìn)行抗菌活性和抗癌活性篩選；對菌株SXW-05在三種鑒定培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基)上的菌落培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)特征的觀察及18S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合真菌鑒定手冊(魏景超)綜合判斷，確定該菌株的種屬地位；以PDA液體培養(yǎng)基中25℃，210 r/min發(fā)酵8天后所得產(chǎn)物用乙酸乙酯充分

5、萃取，濃縮成浸膏，采用用薄層層析、柱層析、高效液相色譜、重結(jié)晶等分離方法結(jié)合活性追蹤對其活性產(chǎn)物進(jìn)行分離純化；利用質(zhì)譜、紫外、核磁共振等波譜手段對所得活性單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；采用MTT法對單體進(jìn)行抗腫瘤活性評價，以宮頸癌Hela、結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為受試細(xì)胞，測定該化合物對這兩種癌細(xì)胞的增殖抑制率，對活性單體抗腫瘤活性的實現(xiàn)初步評價。
　　 研究結(jié)果：本文從三峽庫區(qū)巫山土壤樣品中共分離獲得形態(tài)各異的真菌20株。經(jīng)活性篩選后發(fā)現(xiàn)一

6、株發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)、藤黃八疊球菌(Sarcinalutea)均有明顯抑制作用，并且對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480表現(xiàn)出抑制活性的菌株，將其作為為最終研究的目標(biāo)菌株，并命名為SXW-05。經(jīng)過菌落形態(tài)、顯微形態(tài)觀察，菌種鑒定后，確定該菌株與土曲霉Aspergillus terreus同源性最高，為98

7、％，并且與Aspergillus terreus FJ878634.1處于同一分支，親緣關(guān)系最近。對菌株SXW-05進(jìn)行菌落觀察時，發(fā)現(xiàn)在PDA固體平板上生長情況最為良好，因此最終確定該菌株的發(fā)酵條件為：PDA液體培養(yǎng)基中25℃，210 r/min發(fā)酵8天，經(jīng)過乙酸乙酯充分萃取后得到浸膏5kg，將其分離純化后最終得到一個有抗腫瘤活性單體FB44，對其結(jié)構(gòu)鑒定后確定該化合物為4，5-二羥基-3-丙烯基-1-環(huán)戊烯基-1-酮，與文獻(xiàn)報道的t

8、errein結(jié)構(gòu)一致。對單體FB44進(jìn)行抗腫瘤活性評價，以宮頸癌Hela、結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、肺癌細(xì)胞A549為受試細(xì)胞，測定化合物FB44分別對兩種癌細(xì)胞的增值抑制率，測定其IC50值分別為0.03mM、0.23mM、9μM，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。
　　 結(jié)論：本文最終從三峽庫區(qū)土壤分離到具有抗腫瘤活性的真菌AspergillusterreusSXW-05，并得到其主要代謝產(chǎn)物之一化合物4，5-二羥基-3-丙烯基-2-環(huán)戊