骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生EMT中的pre-mRNA選擇性剪接調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　 1．探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對HT-29細(xì)胞和HCT-8細(xì)胞所形成腫瘤生長和分化的影響。
　　 2．研究BMSCs微環(huán)境對于HT-29細(xì)胞發(fā)生EMT及其相關(guān)pre-mRNA選擇性剪接的影響，分析相關(guān)剪接因子在其中表達(dá)水平的改變。
　　 3．探索PTB基因?qū)τ贖T-29細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。
　　 方法：
　　 1．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將裸鼠分為BMSCs組、HT-29組、BMSCs+

2、HT-29組、HCT-8組和HCT-8+BMSCs組。分別將相應(yīng)細(xì)胞懸液注射到裸鼠皮下，測量形成腫瘤體積，7周后取材、稱重并進(jìn)行HE染色；Realtime RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色檢測上皮標(biāo)志基因E-CADHERIN表達(dá)水平。
　　 2．體外隔離共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：采用Transwell隔離共培養(yǎng)小室將HT-29細(xì)胞與BMSCs進(jìn)行隔離共培養(yǎng)，觀察HT-29細(xì)胞形態(tài)改變，RT-PCR檢測EMT相關(guān)基因表達(dá)以及FGFR2、CD44和

3、ENAH的選擇性剪接方式，同時(shí)檢測FGFR2剪接調(diào)控因子的表達(dá)水平。
　　 3．PTB基因敲減實(shí)驗(yàn)：HT-29細(xì)胞中將PTB基因敲減后檢測EMT相關(guān)基因的表達(dá)以及FGFR2、CD44和ENAH的選擇性剪接方式。
　　 結(jié)果：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，BMSCs組未見腫瘤形成，HT-29+BMSCs組形成腫瘤質(zhì)量和體積與HT-29組無明顯差異，但腫瘤分化水平更低，且E-CADHERIN表達(dá)水平更低。HCT-8+BMS

4、Cs組形成腫塊質(zhì)量和體積與HCT-8組亦無明顯差異，且腫瘤分化程度亦差異不明顯，但均明顯低于HT-29組和HT-29+BMSCs組。
　　 2．與BMSCs體外隔離共培養(yǎng)后HT-29細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT樣改變，EMT相關(guān)基因表達(dá)水平亦發(fā)生相應(yīng)改變，同時(shí)FGFR2、CD44和ENAH由上皮特異性剪接方式轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)特異性剪接方式。參與FGFR2pre-mRNA選擇性剪接的基因TIA1、TIAL1、ESRP1、ESRP2、hnRNPM

5、、hnRNPH、hnRNPF、ASF/SF2、RBM38、PTB和C-MYC表達(dá)下調(diào)，而FOX2、MRG15和hnRNPA1表達(dá)水平無明顯改變。
　　 3．HT-29細(xì)胞在敲減PTB基因后，形態(tài)上可見其失去部分上皮細(xì)胞特征，F(xiàn)GFR2、CD44和ENAH剪接方式發(fā)生相應(yīng)改變，同時(shí)上皮標(biāo)志基因E-CADHERIN表達(dá)下調(diào)，ESRP1和ESRP2表達(dá)水平明顯下調(diào)，但間充質(zhì)細(xì)胞特異基因VIMENTIN表達(dá)未發(fā)生明顯上調(diào)，三個(gè)重要的EM

6、T的調(diào)控因子SNAIL、SLUG和TWLST表達(dá)水平無明顯增加，MRG15表達(dá)水平亦無明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1．三倍數(shù)目的BMSCs沒有明顯改變HT-29細(xì)胞和HCT-8細(xì)胞所形成腫瘤的體積和質(zhì)量，但BMSCs的存在使HT-29細(xì)胞形成腫瘤分化水平更低。
　　 2．BMSCs微環(huán)境能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞發(fā)生EMT，影響HT-29細(xì)胞重要剪接因子的表達(dá)，并引起FGFR2、CD44和ENAH剪接方式的改變。<