下丘腦垂體腎上腺軸反應(yīng)對骨髓干細胞的動員作用與分子機制.pdf

1、全球范圍內(nèi)由創(chuàng)傷引起的死亡人數(shù)持續(xù)升高，預(yù)計到2020年會達到840萬，而嚴重組織損傷是致死致殘的關(guān)鍵因素，因此尋找早期有效修復(fù)損傷組織、預(yù)防和控制創(chuàng)傷并發(fā)癥的治療方法是提高嚴重創(chuàng)傷患者生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。近年來，成體干細胞為嚴重損傷組織的修復(fù)帶來新的曙光。在成年個體中，定植于骨髓中的干細胞可以動員并向損傷組織遷移，作為種子細胞直接參與損傷組織的修復(fù)。此外，成體干細胞還具有免疫調(diào)節(jié)作用，如間充質(zhì)干細胞(mesenchymal ste

2、m cells，MSCs)可以抑制T、B、NK細胞的增殖和B細胞的遷移；抑制TH1細胞分泌促炎細胞因子，促進TH2細胞產(chǎn)生抗炎細胞因子等。雖然外源性干細胞移植在損傷組織治療中具有重要價值，然而這種方法還有諸多倫理和技術(shù)瓶頸需要面對，如干細胞體外擴增、鑒定及其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸等等。損傷組織修復(fù)需要骨髓干細胞的動員，并作為種子細胞遷移到損傷部位。但是目前臨床上所用的干細胞動員劑具有很多副作用，近30%的病人會出現(xiàn)骨痛、頭痛、四肢乏力等癥狀，嚴重

3、者甚至發(fā)生急性肺損傷，部分伴有基礎(chǔ)疾患的創(chuàng)傷患者對干細胞動員劑不敏感。因此，探索內(nèi)源性干細胞動員機制具有重要科學意義和臨床價值。
　　 近年發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對骨髓干細胞動員、增殖、分化和修復(fù)功能有潛在調(diào)控作用，如交感腎上腺髓質(zhì)和其他內(nèi)分泌器官源性激素(如去甲腎上腺素、雌激素)可以促進不同類型骨髓干細胞從骨髓池外流。鑒于神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對于骨髓干細胞數(shù)量的影響，以及效應(yīng)激素在損傷微環(huán)境中的重要作用，我們推測下丘腦-垂體-腎上腺(

4、hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸激活可能是下丘腦-骨髓-外周血三位一體的干細胞動員策略的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本研究以HPA軸及其關(guān)鍵效應(yīng)激素-糖皮質(zhì)激素為切入點，探討其對骨髓干細胞(HSCs、MSCs、EPCs)動員的影響及作用機制，進而初步探討神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對骨髓干細胞的動員及后續(xù)損傷組織修復(fù)和再生的影響，旨在從骨髓干細胞動員角度為損傷組織修復(fù)另辟蹊徑，從而更好地促進損傷組織實現(xiàn)功能修復(fù)。
　

5、　 方法：繁育并鑒定CRH野生型(CRH+/+)小鼠和CRH基因敲除(CRH－/－)小鼠；將CRH野生型(CRH+/+)小鼠和CRH基因敲除(CRH-/-)小鼠分為強迫跑步應(yīng)激組和對照組。應(yīng)激后1h，通過摘眼球取血法獲取足量抗凝血。ELISA法測定血漿皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)濃度。外周血間充質(zhì)干細胞(MSCs)、內(nèi)皮祖細胞(EPCs)和造血干細胞(HSCs)的數(shù)量通過流式細胞分析法確定；利用微量注射泵對CRH+

6、/+和CRH-/-小鼠分別輸注不同劑量的糖皮質(zhì)激素，以上述方法分別檢測小鼠血漿皮質(zhì)酮濃度，及其與外周血EPCs、MSCs和HSCs數(shù)量變化的關(guān)系；分離培養(yǎng)骨髓MSCs和EPCs，用糖皮質(zhì)受體阻斷劑RU486(10μM)預(yù)處理30 min，通過neuro probe趨化小室法觀察不同濃度(0ng/ml、75ng/ml、100 ng/ml、1500 ng/ml)的糖皮質(zhì)激素對MSC、EPC趨化功能的影響及其趨化受體fMLP-R表達變化。

7、r>　　 結(jié)果：1.跑步應(yīng)激后CRH+/+小鼠血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高，同時其外周血MSCs、EPCs的數(shù)量也顯著增加；但CRH-/-小鼠血漿皮質(zhì)酮水平在跑步應(yīng)激后沒有明顯變化，同時其外周血MSCs和EPCs的數(shù)量減少；2.給CRH+/+和CRH-/-小鼠注射糖皮質(zhì)激素后，其血漿皮質(zhì)酮水平都顯著增加，同時外周血HSCs、MSCs、EPCs的數(shù)量也顯著升高：3.低濃度皮質(zhì)酮可以促進骨髓MSCs、EPCs向fMLP的趨化運動；RU486預(yù)處

8、理可以逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對MSCs和EPCs趨化功能的影響；4.不同濃度的糖皮質(zhì)激素均可以促進骨髓MSCs、EPCs fMLP-R mRNA表達，且低濃度的糖皮質(zhì)激素可以促進fMLP-R蛋白的表達，這種作用可被RU486逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：1.急性應(yīng)激條件下，間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞發(fā)生顯著的動員反應(yīng)，HPA軸反應(yīng)及其關(guān)鍵效應(yīng)激素-糖皮質(zhì)激素發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)效應(yīng)；2.在干細胞動員中，糖皮質(zhì)激素可通過上調(diào)fMLP-R，經(jīng)糖皮質(zhì)激素受體基