血必凈對脂多糖及高糖作用下大鼠腹膜間皮細胞炎癥因子表達的影響.pdf

1、腹膜透析是終末期腎臟病主要替代療法之一。但在長期的腹膜透析過程中，不可避免地發(fā)生腹膜透析相關(guān)性腹膜炎，引起腹膜炎癥細胞的浸潤及腹膜細胞外基質(zhì)的沉積，最終導致腹膜透析失敗。脂多糖（lipopolysaceharide，LPS）是大腸桿菌的主要致病物質(zhì)，是其唯一內(nèi)毒素。LPS主要來源于長期腹膜透析引起的導管相關(guān)性感染，其次腸道內(nèi)細菌可穿過通透性增高的腸壁進入腹腔。LPS和腹膜透析液中的高濃度葡萄糖是引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化的主要原因。腹

2、膜間皮細胞作為腹膜的主要構(gòu)成細胞，是腹膜透析時與腹膜透析液接觸的第一道生理屏障，是腹膜損傷反應(yīng)的第一步。研究腹膜間皮細胞在LPS及高糖作用下的反應(yīng)是研究腹膜損傷機制和干預(yù)腹膜損傷的基礎(chǔ)。
　　 腫瘤壞死因子可啟動IL-1等多種炎癥因子的表達和分泌，是一種非常重要的早期炎癥因子。高遷移率族蛋白-1（high mobility group box-1，HMGB-1）是新近發(fā)現(xiàn)的晚期炎癥介質(zhì)，參與了內(nèi)毒素的致死效應(yīng)。而LPS和TNF-

3、α均可刺激HMGB-1的合成，HMGB-1反過來又可延遲激活體內(nèi)單核/巨噬細胞等多種炎性細胞，引起TNF-α水平再度增高，二者相互誘生、相互促進，從而使炎癥反應(yīng)不斷放大，持續(xù)加重組織損害。同時，HMGB-1的遷移性也是決定特定細胞壞死或凋亡的關(guān)鍵信號。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種多功能炎癥活性因子，是直接聯(lián)系腹膜炎與腹膜纖維化的關(guān)鍵因子。我們通過研究細菌脂多糖（li

4、poplysaccharide，LPS）對PMC分泌TNF-α、HMGB-1和TGF-β1的影響及三者之間可能存在的關(guān)系，進一步探討腹膜炎的發(fā)生發(fā)展過程及其介導腹膜損傷和纖維化發(fā)生的可能機制。
　　 血必凈是中藥復方制劑，在治療多種炎癥及纖維化疾病中具有較好療效。本研究通過觀察血必凈對脂多糖作用下大鼠腹膜間皮細胞TNF-α和HMGB-1表達的影響，探討血必凈能否通過抑制二者的表達，起到抑制炎癥擴大、保護腹膜的作用。另外，我們還通

5、過觀察血必凈對高糖誘導的PMC HMGB-1及TGF-β1表達的影響，明確血必凈是否具有抑制高糖對PMC分泌細胞因子的作用，從而保護PMC，發(fā)揮潛在的抗腹膜纖維化作用。
　　 方法：
　　 1、實驗用動物
　　 雄性SD大鼠（體重120-160g，清潔級，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。
　　 2、胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)大鼠PMC，用RT-PCR法檢測HMGB-1mRNA的表達，ELISA法測TNF-α

6、、HMGB-1和TGF-β1蛋白表達。
　　 細胞分組：
　　 （1）不同濃度LPS組：0，1，10，100mg/L
　　 （2）10mg/L LPS作用不同時間組：0，2，6，12，18，21，24，36h
　　 （3）10mg/L LPS預(yù)孵育2h后，加入不同濃度血必凈（2，10，20g/L）再作用4，22h
　　 （4）2.5％高糖作用不同時間組：0，18，24，36h.
　　 （5

7、）2.5％高糖加入不同濃度血必凈（2，10，20g/L）再作用18，24，36h
　　 結(jié)果：
　　 1、LPS對PMC HMGB-1表達的影響
　　 1mg/L LPS可使PMC的HMGB-1mRNA和蛋白質(zhì)表達增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最強（P<0.01）；10mg/L LPS作用18h后PMC的HMGB-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達增加（P<0.05），36h時表達達最大（P<0.01）。

8、
　　 2、LPS對PMC TNF-α表達的影響
　　 1mg/L LPS可使PMC的TNF-α蛋白質(zhì)表達增加（P<0.05），100mg/L LPS作用最強（P<0.01）；10mg/L LPS刺激PMC，TNF-α的含量在LPS刺激后2h開始增高并達峰值，6h到18h表達降低，于21h表達增高達另一峰值（P<0.05）。
　　 3、LPS對PMC TGF-β1表達的影響
　　 TGF-β1的含量在10

9、mg/L LPS刺激后2h開始增高并達峰值，6h降低，12h開始增高并持續(xù)至36h（P<0.05）。
　　 4、血必凈對LPS作用下PMC HMGB-1表達的影響
　　 10g/L血必凈可抑制經(jīng)10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC HMGB-1mRNA表達（P<0.05）；2g/L血必凈可抑制10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC HMGB-1蛋白質(zhì)表達（P<0.05），20g/L血必凈的這種抑制作用最強（P<0.

10、01）。
　　 5、血必凈對LPS作用下PMC的TNF-α蛋白表達的影響
　　 2g/L血必凈可抑制10mg/L LPS預(yù)孵育2h后的PMC TNF-α蛋白的表達（P<0.05），20g/L血必凈組的抑制作用更強（P<0.01）。
　　 6、高糖對PMC的HMGB-1和TGF-β1表達的影響
　　 2.5％高糖作用18h后PMC的HMGB-1和TGF-β1表達增加（P<0.05），作用36h后二者表達達最

11、大（P<0.01）。
　　 7、血必凈對高糖作用下PMC的HMGB-1和TGF-β1表達的影響
　　 加血必凈的葡萄糖組HMGB-1及TGF-β1的含量均顯著低于高糖組（P<0.05），且隨著血必凈濃度升高，HMGB-1及TGF-β1的含量下降，20g/L血必凈組兩者含量最低。
　　 結(jié)論：
　　 1、HMGB-1作為晚期炎癥因子參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的病理過程，LPS通過上調(diào)TNF-α、HMGB-1