左旋咪唑?qū)AE大鼠脊髓炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、背景:20世紀(jì)80年代以來(lái),國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了600多例的"左旋咪唑引起腦炎綜合征(急性脫髓鞘白質(zhì)腦病)".多個(gè)項(xiàng)目的藥物流行病學(xué)研究證實(shí)左旋咪唑(levami sole,LMS)與原因未明脫髓鞘性白質(zhì)腦病存在因果關(guān)系.實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)LMS對(duì)中樞炎性脫髓鞘腦病的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)有明顯的促發(fā)加重作用. 目的：觀察LMS不同

2、階段給藥對(duì)Wistar大鼠EAE發(fā)病的影響及對(duì)其脊髓炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,探討LMS促發(fā)加重EAE的可能機(jī)制. 方法：Wistar大鼠四肢足墊皮下注射豚鼠脊髓勻漿(guinea pig spinal cordhomogenate,GPSCH)和完全弗氏佐劑(complete Freud'S adjuvant,CFA)制成的乳劑,免疫誘導(dǎo)EAE模型.將雌性Wistar大鼠45只,隨機(jī)分成五組:CFA對(duì)照組(8只)、EAE模型

3、組(8只)、LMS免疫前給藥組(LMS 1組,10只)、LMS免疫同時(shí)給藥組(LMS 2組,9只)、LMS免疫后間斷給藥組(LMS 3組,10只).LMS 1組、LMS 2組、LMS 3組的大鼠分別在GPSCH-CFA免疫前、免疫同時(shí)、免疫后腹腔注LMS 10mg·kg<'-1>.GPSCH-CFA免疫當(dāng)日定為第0天,每同兩次觀察并記錄動(dòng)物行為學(xué)及體重的變化.采用量化評(píng)分法,比較LMS不同階段給藥對(duì)EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評(píng)分及病理組

4、織學(xué)評(píng)分的影響;免疫組織化學(xué)法測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidiC protein,GFAP)表達(dá),并進(jìn)行定量分析;同時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)法測(cè)大鼠脊髓干擾素-γ(interferon-Y,IFN-Y)、白介素-12

5、/23 P40(inter]eukin-12/23 P40,IL-12/23 P40)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)mRNA的表達(dá),并將各細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平與臨床癥狀評(píng)分作相關(guān)性分析. 結(jié)果：(1)行為學(xué)觀察:大鼠于免疫后11天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病,EAE組發(fā)病率3/8(37.5﹪),潛伏期13.67±1.1

6、5天;LMSl組發(fā)病率5/10(50.0﹪),潛伏期14.40±2.07天,與EAE組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;LMS2組發(fā)病率8/9(88.9﹪),潛伏期14.00±1.19天,發(fā)病率較EAE組高(P<0.05).病情嚴(yán)重程度相比,LMSl組和LMS2組較EAE組重:LMSl組的最大癥狀評(píng)分平均值(3.80±0.45)較EAE組(2.00±1.00)高(P<0.01),LMS2組的最大癥狀評(píng)分平均值(2.50±0.76)較EAE組略高,但統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)上差異無(wú)顯著性;免疫后14天癥狀評(píng)分平均值比較,LMSl組(2.50±0.71)和LMS2組(2.00±0.00)均較EAE組(1.00±0.00)高(P<0.01,P<0.05).LMS1組和LMS2組的達(dá)最大癥狀時(shí)間(2.40±0.54天,2.00±0.53天)較EAE組(3.67±0.57天)短,提示LMS1組和LMS2組病情進(jìn)展快.LMS3組首次發(fā)病率為2/10(20.0﹪),發(fā)病潛伏期、達(dá)峰時(shí)間、最大癥狀評(píng)分與EAE組比均無(wú)

8、顯著性差異;發(fā)病的2只大鼠癥狀持續(xù)5-6天即完全緩解,并分別在免疫后第23、25天相繼再次出現(xiàn)后肢無(wú)力、癱瘓等EAE癥狀,但是持續(xù)時(shí)間較短,2-3天即恢復(fù).(2)病理學(xué)變化:HE染色見(jiàn)發(fā)病大鼠CNS有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以淋巴細(xì)胞為主,分布以腦干和腰髓居多,主要表現(xiàn)為血管套形成,噬神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)等.LMS1組和LMS2組炎癥浸潤(rùn)較EAE組重(P<0.05),LMS3組的炎癥浸潤(rùn)程度與EAE組差不多.Kluver&Barrera髓鞘

9、染色見(jiàn)發(fā)病大鼠CNS內(nèi)有大小不等的片狀髓鞘脫失,大多局限在炎癥改變明顯的血管套周?chē)陌踪|(zhì)區(qū).CFA對(duì)照組大鼠CNS未見(jiàn)異常病理表現(xiàn).(3)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的免疫組化結(jié)果:CFA對(duì)照組CNS僅有少量細(xì)小突起著色的星形膠質(zhì)細(xì)胞:而EAE組CNS的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比CFA對(duì)照組明顯增加(P<0.01).與EAE組比,LMS1組及LMS2組CNS的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞染色數(shù)目和染色強(qiáng)度均進(jìn)一步增加(P<0.01);LMS3組與EAE組比無(wú)明

10、顯差異.(4)RT-PCR結(jié)果:與EAE組比,LMS1組脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達(dá)升高,TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)下降,但僅IL-10有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);LMS2組脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達(dá)升高(P<0.05,P<0.01),TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)下降(P<0.05,P<0.01);LMS3組除IL-12/23 P40 mRNA有顯著升高(P<

11、0.01)外,其他無(wú)顯著差異;CFA對(duì)照組脊髓細(xì)胞因子表達(dá)水平都很低(P<0.01).相關(guān)性分析結(jié)果顯示,脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達(dá)水平與臨床癥狀評(píng)分呈正相關(guān),脊髓TGF-β1和IL-10 mRNA表達(dá)水平與臨床癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān). 結(jié)論：(1)左旋咪唑免疫前給藥能加重Wistar大鼠EAE的臨床癥狀,加速病情進(jìn)展,并能加重其中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失;(2)左旋咪唑免疫同時(shí)給藥能使Wistar

12、大鼠EAE發(fā)病率增加,臨床癥狀加重,病情進(jìn)展加速,并能加重其中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失:(3)左旋咪唑免疫后間斷給藥能促使Wistar大鼠EAE復(fù)發(fā):(4)EAE病情的輕重與Th1類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)呈正相關(guān),與Th2/Th3類(lèi)細(xì)胞因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);(5)左旋咪唑能促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)Th1類(lèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA的表達(dá),抑制Th2/Th3類(lèi)細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10 mRNA的表達(dá),導(dǎo)致Th1/