鈣激活氯通道DOG1與胃腸間質(zhì)瘤(GISTs)增殖關(guān)系初探.pdf

1、背景：
　　胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是消化道最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，多數(shù)胃腸間質(zhì)瘤發(fā)病的關(guān)鍵因素為獲得性突變的PDGFRA和KIT酪氨酸激酶異常活化。雖然酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼（Imatinib Mesylate）作為治療轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及不可切除胃腸間質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)一線治療的靶向藥物取得了良好的臨床效果，但臨床工作者在臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)仍有部分病人對(duì)伊馬替尼耐藥，其中有原發(fā)性耐藥

2、及繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致治療這些胃腸間質(zhì)瘤患者變得非常棘手。研究發(fā)現(xiàn)，DOG1特異性表達(dá)于胃腸間質(zhì)瘤，敏感性極高，作為診斷GIST而與其他的肉瘤相鑒別的標(biāo)志物，可能參與胃腸間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　沉默GIST-T1細(xì)胞株DOG1后觀察細(xì)胞株的增殖是否受到抑制；初步探索鈣激活氯通道DOG1與胃腸間質(zhì)瘤（GISTs）增殖凋亡之間的關(guān)系，尋找胃腸間質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)，為治療胃腸間質(zhì)瘤伊馬替尼原發(fā)性耐藥及繼發(fā)性耐藥患者提供聯(lián)合治

3、療的理論依據(jù)。
　　方法：
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默GIST-T1細(xì)胞株DOG1基因，采用RT-qPCR篩選最佳干擾質(zhì)粒；采用CCK法檢測(cè)GIST-T1細(xì)胞株DOG1沉默前后細(xì)胞株的增殖情況；CCK法檢測(cè)DOG1沉默后是否影響imatinib的藥物敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)imatinib處理后各組細(xì)胞的凋亡情況及觀察DOG1干擾前后GIST-T1細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布情況；利用Western blotting蛋白半定量方法測(cè)

4、定DOG1干擾前后DOG1、KIT及KIT相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況；利用graph prism軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究分析 DOG1沉默前后 G1IST-T細(xì)胞株的增殖情況及DOG1沉默前后KIT通路蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、DOG1mRNA的RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果示：shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4質(zhì)粒干擾 GIST-T1細(xì)胞株后，DOG1mRNA的表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.799

5、9倍、0.3814倍、0.8526倍、0.9669倍。
　　2、干擾0min、60min時(shí)干擾組GIST-T1細(xì)胞與未干擾組GIST-T1細(xì)胞相比，兩組之間的OD值無(wú)顯著差異（P>0.05）；但在干擾120min、240min時(shí)兩組之間OD值差異明顯（P<0.05）。
　　4.imatinib毒性試驗(yàn)表明其在GIST-T1細(xì)胞株的IC50在10-2-10-1mg/ml。
　　5、與單純DOG1mRNA干擾細(xì)胞組比較，D

6、OG1mRNA干擾組細(xì)胞株經(jīng)0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml不同濃度的imatinib處理后，OD值未見(jiàn)明顯不同差異（P>0.05）；而 DOG1mRNA干擾組的細(xì)胞經(jīng)10ug/ml、100ug/ml濃度的imatinib處理后，兩組的OD值有顯著差異（P<0.001）。
　　6、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml三個(gè)不同濃度imatinib處理GIST-T1細(xì)胞株及DOG1mRNA干擾的GIST

7、-T1細(xì)胞后兩組細(xì)胞的OD值有顯著差異（P<0.01）；而10ug/ml、100ug/ml高濃度的imatinib處理干擾前后兩組細(xì)胞株，這兩組之間的OD值無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　　7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況：對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)100ug/ml藥物imatinib處理后D4期即早期凋亡的細(xì)胞百分比由4.5％增加到23.0%；陰性對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)100ug/ml藥物imatinib處理后D4期細(xì)胞百分比由4.8%增加到19.

8、6%；SH-2組細(xì)胞經(jīng)100ug/ml藥物imatinib處理后D4期細(xì)胞由4.3%增加到12.3%。
　　8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況：對(duì)照組中G1期細(xì)胞占57.1%，S期細(xì)胞占42.9%；陰性對(duì)照組中G1期細(xì)胞占57.5%，S期細(xì)胞占41.3%；SH-2組的G1期細(xì)胞占61.7%，S期細(xì)胞占37.8%。
　　9、SH-2組及SH-2(+)組DOG1蛋白的表達(dá)量較C組的表達(dá)量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

9、05），而C(+)組DOG1的表達(dá)與C組相比較差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SH-2組p-KIT的表達(dá)較C組并無(wú)明顯變化,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但是 C(+)組的p-KIT表達(dá)量較 C組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C(+)組、SH-2組、SH-2（+）組的AKT、p-AKT表達(dá)量與C組相比差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C（+）組、SH-2組、SH-2（+）組p-ERK1/2的表達(dá)量與C組相比，

10、p-ERK1/2下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：
　　1、DOG1mRNA最佳的干擾質(zhì)粒對(duì)為shRNA-2，其干擾序列（5’-3’）為：CCTCACGGGCTTTGAAGAG。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)表明：GIST-T1細(xì)胞株的DOG1mRNA沉默成功后，可抑制GIST-T1細(xì)胞的增殖，說(shuō)明DOG1參與調(diào)節(jié)GISTs的增殖；流式細(xì)胞術(shù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)DOG1可將細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期，DOG1可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)

11、胞周期G1/S期來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。
　　3、GIST-T1細(xì)胞DOG1基因沉默與否并不影響imatinib的藥物敏感性，與imatinib并不具有雙重抑制GIST-T1細(xì)胞增殖的能力。
　　4、沉默GIST-T1細(xì)胞株DOG1mRNA前后p-KITY703以及KIT下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯改變；但是下調(diào)DOG1后p-ERK1/2的表達(dá)量顯著減少，說(shuō)明了DOG1通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路而不是通過(guò)KIT信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖