樹突狀細(xì)胞在胃癌組織中的功能變化及其抗癌作用的實驗研究.pdf

1、研究內(nèi)容和結(jié)果如下：第一部分胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中浸潤性樹突狀細(xì)胞功能變化及其臨床意義 目的：研究胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中浸潤性樹突狀細(xì)胞(tumorinfiltratingdendriticcell，TIDC)的DC特異標(biāo)志CD83及共刺激分子CD80、CD86的表型變化，探討胃癌及區(qū)域淋巴結(jié)中TIDC功能狀態(tài)與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其與胃癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。 方法：提取胃癌組織、癌旁組織、正常胃組織、有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移區(qū)域淋巴結(jié)中的

2、TIDC，并經(jīng)細(xì)胞因子體外刺激擴(kuò)增，流式細(xì)胞術(shù)檢測TIDC的CD83、CD80、CD86表型變化，探討其與胃癌發(fā)生、發(fā)展及與胃癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系。 結(jié)果1胃癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)、正常胃組織中TIDC經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后，在倒置顯微鏡下和瑞氏染色后形態(tài)觀察可見典型的樹突狀改變，細(xì)胞呈不規(guī)則的圓形，周邊可見樹突狀突起。 2胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織中TIDC的CD83表達(dá)分別為7.24±2.09％、11.73±2.62％、12

3、.92±3.28％；CD80的表達(dá)分別為5.39±1.9％、9.32±2.05％、10.61±2.60％；CD86表達(dá)分別為15.01±3.22％、19.97±5.31％、21.24±4.90％，胃癌組織中TIDC的CD83、CD80和CD86的表達(dá)分別顯著低于癌旁組織及正常胃組織，差異有顯著性(P＜0.01)。3在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TIDC的CD83表達(dá)分別為8.17±1.67％、13.58±3.71％；CD80的表達(dá)分別為6.6

4、0±1.27％、11.79±2.52％；CD86的表達(dá)分別為13.89±3.46％、22.02±5.18％，有轉(zhuǎn)移組TIDC的CD83、CD80和CD86的表達(dá)分別顯著低于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，差異有顯著性(P＜0.01)。 4胃癌組織中TIDC的CD83、CD80、CD86表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。而三者在低分化腺癌組、有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組和Ⅲ+Ⅳ期組的表達(dá)明顯低于高中分化組、無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組、Ⅰ+Ⅱ期組，

5、差異有顯著性(P＜0.01或0.05)。 結(jié)論：胃癌組織和有轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)中成熟TIDC數(shù)量減少、共刺激分子表達(dá)下降，DC的抗原提呈功能低下，機(jī)體對胃癌細(xì)胞的識別能力減退，從而產(chǎn)生胃癌免疫逃逸，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。胃癌組織中TIDC的功能狀態(tài)可能受到胃癌細(xì)胞本身特性的影響。為闡明胃癌免疫逃逸機(jī)制、開展胃癌的免疫生物學(xué)治療提供了理論和臨床基礎(chǔ)。 第二部分人外周血樹突狀細(xì)胞的擴(kuò)增及人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對其表型的影響

6、 目的：研究不同人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液對人外周血成熟DC表型的影響，探索DC功能下降的機(jī)制，為胃癌的免疫生物治療提供實驗依據(jù)。 方法：自健康人外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取大量具有典型形態(tài)學(xué)特征的DC，掃描電鏡、透射電鏡觀察DC的形態(tài)，F(xiàn)CM檢測DC的CD83、CD80、CD86、HLA-DR表型。并獲取不同胃癌細(xì)胞及正常胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫法檢測上清液中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長

7、因子-β1(TGF-β1)蛋白含量。DC培養(yǎng)液中加入胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表型的變化。 結(jié)果1DC的形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察DC細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的毛刺狀突起。掃描電鏡觀察DC表面粗糙，胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起。透射電鏡觀察成熟DC的胞體較大，可見明顯的突起。胞漿細(xì)胞器，如粗、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體、高爾基體等較發(fā)達(dá)。 2DC的表型測定：培養(yǎng)第7d的DC高表達(dá)CD83、H

8、LA-DR，表達(dá)率分別為(61.94±5.87)％、(72.26±7.65)％，中度表達(dá)CD80、CD86，表達(dá)率分別為(43.81±6.19)％、(51.07±4.32)％，較第4天均顯著升高，差異有顯著性(P＜0.01)。在培養(yǎng)過程中不加刺激因子DC的CD83表型基本不表達(dá)，HLA-DR、CD80、CD86的表達(dá)明顯低于加刺激因子的DC，差異有顯著性(P＜0.01)。 3在培養(yǎng)上清液中，三種人胃癌細(xì)胞均可檢到VEGF蛋白，I

9、L-10、TGF-β1蛋白在OCUM-2MD3、BGC-823細(xì)胞株中有表達(dá)，在HGC-27中未見表達(dá)。而在正常胃上皮細(xì)胞GES-1中均未檢測到這三種免疫抑制因子。4加入胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各胃癌細(xì)胞組DC的CD83、HLA-DR表型及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)，而正常胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液對DC表型無顯著影響。 結(jié)論：經(jīng)提取人外周血PBMC，GM-CSF、IL-4和TNF-α體外

10、刺激，可擴(kuò)增出大量成熟、具備抗原提呈能力的DC，該方法簡便、易行、高效。胃癌細(xì)胞可通過分泌VEGF、IL-10、TGF-β1等免疫抑制因子抑制DC成熟，降低其抗原提呈功能，使胃癌發(fā)生免疫逃逸。 第三部分胃癌細(xì)胞抗原致敏的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和殺傷效率的實驗研究目的：探討胃癌細(xì)胞抗原致敏的DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和殺傷胃癌細(xì)胞的效率，為胃癌的免疫生物治療提供新的治療途徑和實驗依據(jù)。 方法：自健康人外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取成

11、熟DC，自同一人提取外周血、擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其CD3、CD4、CD8及CD56表型。 以人胃癌OCUM-2MD3細(xì)胞株凍融抗原致敏DC，MTT法檢測致敏DC對T細(xì)胞增殖的影響和致敏DC活化的特異性CTL對胃癌細(xì)胞的體外殺傷效率。 結(jié)果1人外周血中提取的PBMC，在體外培養(yǎng)，經(jīng)rhIL-2、rhGM-CSF刺激后，可獲大量表達(dá)CD3的T淋巴細(xì)胞。 2經(jīng)MTT法檢測胃癌細(xì)胞抗原致敏DC對人外周血T淋巴細(xì)

12、胞增殖的影響，可見致敏DC組的SI值為0.573±0.115，未致敏DC組為0.183±0.074、對照組為0.185±0.026、空白組為0.176±0.053，致敏DC組刺激指數(shù)顯著高于其它三組，差異有顯著性(P＜0.01)。 3經(jīng)FCM檢測，胃癌細(xì)胞抗原致敏DC主要刺激人外周血T淋巴細(xì)胞增殖為CD8+表達(dá)陽性的CTL(60.58±8.43)％，顯著高于其它組，差異有顯著性(P＜0.01)。 4與未致敏DC組和對照組

13、相比，經(jīng)胃癌細(xì)胞抗原致敏DC激活的T淋巴細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)顯著增加，差異有顯著性(P＜0.01)。并且隨效靶比增加，殺傷效應(yīng)亦顯著增加(P＜0.01)。 結(jié)論：自外周血中提取的PBMC，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增可獲大量T淋巴細(xì)胞。胃癌細(xì)胞抗原致敏DC可顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖為CD8+細(xì)胞毒CTL。胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化的特異CTL在體外具有高效殺傷胃癌細(xì)胞的作用。本研究為胃癌的免疫生物治療提供了新的治療途徑和實驗依據(jù)。 第

14、四部分樹突狀細(xì)胞活化的特異性CTL對人胃癌裸鼠移植瘤生長增殖的影響 目的：研究胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化的特異性CTL對人胃癌裸鼠移植瘤生長和增殖的影響，為DC應(yīng)用于胃癌免疫治療提供理論和動物實驗依據(jù)。 方法：構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型，皮下注射胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化的特異CTL，測量移植瘤大小、重量，光鏡、電鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞比率及凋亡率，研究胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化

15、的特異CTL在體內(nèi)對胃癌的作用。 結(jié)果1胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化的特異性CTL作用后裸鼠皮下移植瘤的體積和重量分別為(0.87±0.21)cm3、(1.03±0.24)g，明顯小于非抗原特異CTL組和對照組，差異有顯著性意義(P＜0.01)。 2裸鼠人胃癌移植瘤形態(tài)學(xué)觀察：光鏡和透射電鏡觀察抗原特異CTL組瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死、退變，還可見瘤細(xì)胞表現(xiàn)不同程度的體積縮小，與鄰近的瘤細(xì)胞脫離，細(xì)胞核皺縮、核碎裂，核碎

16、片有膜包裹等凋亡形態(tài)學(xué)改變。 3胃癌細(xì)胞抗原致敏DC活化的特異性CTL作用后裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞的增殖值數(shù)為24.39±2.46％，顯著低于非抗原特異CTL組(31.24±3.85％)和對照組(32.78±4.17％)，P＜0.01；而凋亡細(xì)胞比率為15.83±2.77％，顯著高于非抗原特異CTL組(7.28±2.26％)和對照組(9.15±1.33％)，(P＜0.01)。 結(jié)論：應(yīng)用具有高侵襲轉(zhuǎn)移特性的人胃癌OCUM-2