洛伐他汀對HepG-,2-細胞生長抑制作用研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(PHC)分為肝細胞癌(HCC，占95％)、膽管細胞癌(CCC，占3％)和混合型癌。HCC是常見的惡性腫瘤，高居中國癌癥死亡率第二位，有病程短，手術切除率低，預后差的特點。手術切除腫瘤、經皮消融治療和肝移植是治療HCC的有效方法。但多數(shù)HCC患者就診時已是中、晚期，腫瘤已有血管侵犯、肝內浸潤和遠處轉移，只能行化療、放療等姑息性治療。HCC對常規(guī)劑量的化療藥物不敏感，而更高劑量的化療藥物因毒副作用而使其應用受到限制。近年由于新化

2、療藥物的出現(xiàn)和給藥方式的改進(如經皮瘤內注射、經肝動脈導管持續(xù)灌注、肝段或亞肝段栓塞治療及多種給藥方式結合等)讓人們對化學藥物治療肝癌的看法有所改變。臨床醫(yī)生、科研工作者正努力尋找有效的系統(tǒng)化療方法。 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-CoA還原酶抑制劑，statins)是一類廣泛用于治療高脂血癥的藥物，對心血管疾病有治療和預防作用。自1976年從橘青霉中發(fā)現(xiàn)具有抑制HMG-CoA還原酶的活性物質美伐他汀以來，

3、statins已有三代十余種。近年statins的抗腫瘤作用日益受到重視。臨床前研究認為statins具有抗增殖、促進凋亡、抗侵襲及放射增敏作用?；A研究顯示statins能抑制腫瘤細胞系增殖和動物模型腫瘤生長，而statins的抗腫瘤作用的臨床Ⅰ、Ⅱ期研究也已見零星報道。多數(shù)報道認為statins的抗腫瘤機制可能與其非降脂作用有關。statins是HMG-CoA還原酶強力和高度專一的競爭性抑制劑，通過抑制甲羥戊酸通路的限速步驟而減少甲

4、羥戊酸及其下游產物的生成，對細胞膜結構、信號傳導、蛋白合成和細胞周期等重要細胞功能產生影響，進而調控腫瘤生成、生長和轉移進程。 洛伐他汀(lovastatin，本文中簡稱LOV)是第一個用于臨床的他汀類藥物。本文擬以人肝癌HepG2細胞系為研究對象，不同濃度、不同作用時間的LOV及香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)、法呢酯焦磷酸(FPP)、PD98059為處理因素研究statins的抗腫瘤作用。用常規(guī)光學顯微鏡、熒光顯微鏡、電鏡、平

5、板克隆形成試驗等觀察細胞形態(tài)變化；用生長曲線、MTT試驗觀察細胞增殖抑制情況；用流式細胞儀檢測細胞周期；用姬姆薩染色、熒光顯微鏡、DNAladder試驗、AnnexinV-FITC法等檢測細胞凋亡；用基因芯片、RT-PCR檢測LOV作用前后的細胞基因差異表達；用Westernblot探討一些細胞傳導通路的作用。我們希望通過以上方法較全面地了解statins的抗腫瘤機制，為后續(xù)實驗打下良好基礎。 第一部分洛伐他汀的抑制HepG2細

6、胞增殖作用目的：觀察LOV對人肝癌細胞系HepG2細胞增殖的影響。方法：觀察LOV作用于HepG2細胞前后光鏡下細胞形態(tài)的變化；計算細胞數(shù)繪制細胞生長曲線；用平板克隆形成試驗、MTT試驗檢測細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期，了解LOV是否有抑制HepG2細胞增殖作用，并了解LOV作用后細胞周期的改變及其對細胞增殖的影響。 結果：LOV能抑制HepG2細胞的增殖，隨時間、濃度增加，效應更明顯；LOV能使HepG2細胞的增殖阻滯

7、于G0/G1期，隨濃度增加，效應更明顯；GGPP能完全逆轉LOV的抑制細胞增殖作用，F(xiàn)PP能部分逆轉LOV的抑制細胞增殖作用；ERK1/2的特異阻滯劑PD98059能使HepG2細胞的增殖阻滯于G0/G1期，與LOV合用，效應更為明顯。 結論：LOV能抑制HepG2細胞的增殖，甲羥戊酸通路的類異戊二烯中間產物GGPP、FPP以及ERK的特異阻滯劑PD98059可能影響LOV的抗增殖作用。statins的抗腫瘤作用值得進一步研究。

8、 第二部分洛伐他汀的促進HepG2細胞凋亡作用 目的：觀察LOV對人肝癌細胞系HepG2細胞凋亡的影響。 方法：加入LOV、GGPP、FPP、PD98059，用姬姆薩染色、電鏡、熒光顯微鏡、DNAladder試驗及AnnexinV-FITC法檢測HepG2細胞凋亡情況。 結果：LOV有介導HepG2細胞凋亡的作用，隨時間、濃度增加，效應更明顯；GGPP能完全逆轉LOV的介導凋亡作用，F(xiàn)PP能部分逆轉LOV

9、的介導凋亡作用；LOV與PD98059合用可加強促凋亡作用。 結論：LOV能促進HepG2細胞的凋亡，與GGPP、FPP或PD98059合用對HepG2細胞的凋亡產生不同程度的影響。 第三部分洛伐他汀作用于HepG2細胞前后基因差異表達初步研究 目的：用基因芯片觀察LOV作用前后HepG2細胞的差異表達基因。 方法：LOV20μmol/L作用于HepG2細胞18h，各提取實驗組與對照組細胞總RNA，用cD

10、NA直接標記法制備探針，進行雜交，雜交信號經掃描后，用軟件分析基因表達情況。應用RT-PCR驗證部分差異表達基因。 結果：共檢出LOV作用后表達上調的基因30個，表達下調的基因11個，涉及信號傳導、腫瘤免疫、細胞周期等方面，RT-PCR結果符合基因芯片結果。結論：用基因芯片篩選出的LOV作用后的肝癌細胞差異表達基因為深入研究他汀類藥物的抗癌機制提供重要的理論依據(jù)。 第四部分RhoA和部分信號傳導通路在洛伐他汀抑制HepG

11、2細胞增殖中的作用 目的：探討RhoA在LOV抑制HepG2細胞增殖過程中所起的作用，探討Rho/ROCK和Raf/MEK/ERK信號傳導在此過程中的作用。 方法：用基因芯片、RT-PCR和Westernblot檢測LOV作用前、后HepG2細胞中RhoA的表達。用Westernblot檢測ERK1/2和p38MAPK表達。合用ERK1/2的特異阻滯劑PD98059，用MTT試驗檢測LOV和PD98059的相互作用。

12、 結果：加入LOV后，mRNA(RhoA)和RhoA蛋白水平均上調，加入GGPP或FPP后，RhoA蛋白水平上調被不同程度逆轉。PD98059可以減少HepG2細胞的增殖，與LOV合用效果更明顯。 結論：LOV抑制HepG2細胞生長的作用可能與RhoA的異戊二烯化有關，減少RhoA香葉酯化，抑制RhoA的細胞膜錨著可能是LOV抑制HepG2增殖的機制之一。Rho/ROCK通路可能在此過程中起主導作用，而Ras的異戊二烯化可能

13、是一個輔助機制，Raf/MEK/ERK通路在一定程度上參與LOV的作用機制。ERK1/2傳導途徑可能對HepG2細胞的增殖有影響。 小結LOV能抑制HepG2細胞增殖，促進HepG2細胞凋亡，隨時間、濃度增加，效應更明顯；LOV作用后HepG2細胞中mRNA(RhoA)表達上調，細胞總蛋白中RhoA表達上調，隨時間、濃度增加，效應更明顯。GGPP能完全逆轉LOV的介導的抑制增殖、促進凋亡作用，F(xiàn)PP部分逆轉其作用；PD98059