鉤藤總堿提取工藝優(yōu)化及其抗焦慮作用藥效學(xué)和作用機制的初步研究.pdf

1、1.目的
　　鉤藤屬茜草科植物,帶鉤莖枝入藥,性涼、味甘苦,具有清熱平肝、息風(fēng)定驚的功效,其作為我國傳統(tǒng)中藥已有悠久的使用歷史。現(xiàn)代實驗研究表明,鉤藤生物堿除了具有對心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等藥理作用外還對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響,例如鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇、抗焦慮等。目前國內(nèi)外對鉤藤生物堿的藥理作用研究多集中在鉤藤堿、異鉤藤堿的降壓和腦缺血保護(hù)等藥理作用上,對其可能的抗焦慮藥效學(xué)還少見報道,考慮到鉤藤生物堿對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能產(chǎn)

2、生影響,且具備天然藥物成分安全性較高的特點,有必要對其抗焦慮活性進(jìn)行深入研究。
　　本課題首先對鉤藤總堿(RTA)四個主要有效成分建立檢測時間快、分離效果好的高效液相色譜法(HPLC-UV)分析方法,為鉤藤總堿提取工藝、含量測定及穩(wěn)定性考察奠定定量分析方法;通過含量測定分析方法研究對鉤藤總堿的提取工藝優(yōu)化,建立提取效率高、方法簡易可行且安全的鉤藤總堿(RTA)提取工藝,為后續(xù)進(jìn)一步探討其抗焦慮藥效及作用機制的初步研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ);

3、采用不同的國際通用的抗焦慮動物模型,觀察鉤藤總堿對動物行為學(xué)的影響考察其抗焦慮作用;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測鉤藤總堿對EPM干預(yù)前后大鼠腦組織內(nèi)單胺類遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)的含量變化,認(rèn)識其可能相關(guān)的作用機制。為尋求有效且副作用更小的天然抗焦慮藥物,為我國傳統(tǒng)中藥鉤藤的藥物研發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。
　　2.方法
　　2.1鉤藤總堿的含量測定研究對提取鉤藤總堿中主要有效成分鉤藤堿、

4、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿4個四元環(huán)氧化吲哚生物堿建立檢測時間快、分離效果好的HPLC-UV分析方法,通過分離特異性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性對所建方法考察確證。
　　2.2鉤藤總堿提取工藝優(yōu)化的單因素影響研究通過薄層色譜法定性分析鑒別購買鉤藤藥材;對幾個不同產(chǎn)地的普通鉤藤藥材進(jìn)行篩選,確定鉤藤堿含量高的產(chǎn)地鉤藤作為提取工藝的藥材;以鉤藤堿的產(chǎn)率為響應(yīng)值,在前期預(yù)實驗考察基礎(chǔ)上以乙醇超聲提取法為基礎(chǔ),采取冷

5、浸時間、乙醇百分比、酸化條件、萃取溶劑、萃取溶劑比及萃取次數(shù)多個單因素影響進(jìn)行考察。
　　2.3鉤藤總堿提取工藝正交試驗優(yōu)化研究在單因素影響研究基礎(chǔ)上以3個主要因素物料比為1:5、1:10、1:15,提取次數(shù)為1次、2次、3次,超聲時間為1h、2h、3h,開展三因素三水平的正交實驗(L933),進(jìn)一步確定鉤藤總堿的最優(yōu)提取工藝。
　　2.4鉤藤總堿抗焦慮作用初步藥效學(xué)研究以地西泮作為陽性對照,對自提鉤藤總堿通過大/小鼠高架十

6、字迷宮實驗、小鼠明暗穿箱實驗、小鼠避暗實驗、小鼠期待性焦慮實驗和小鼠戊四唑抗驚厥實驗幾個通用的動物焦慮模型進(jìn)行抗焦慮作用的初步藥效學(xué)研究。
　　2.5鉤藤總堿抗焦慮作用初步作用機制研究:采用ELISA試劑盒測定EPM干預(yù)前后大鼠腦組織中去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化,考察其可能的作用機制。
　　3.結(jié)果
　　3.1鉤藤總堿的含量測定研究高效液相色譜法紫外檢測確定分

7、析波長為245.4nm,色譜分離條件為以Welchrom-C18(4.6×250mm,5μm)色譜柱為固定相,流動相體系為0.01mol/L磷酸二氫鉀(HCl調(diào)PH2.85)-乙腈(70:30),以柱溫25℃、流速1.0mL/min梯度洗脫,0~10min內(nèi)洗脫比例由70:30線性遞減至65:35。該條件下鉤藤總堿樣品的主要有效成分(鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿)保留時間分別于共存雜質(zhì)有效分離。該分析方法確證結(jié)果顯示線性回

8、歸方程分別為鉤藤堿:y=6.17×104x-2.17×104(0.52~66μg/ml,r2=0.998),異鉤藤堿:y=5.77×104x-1.20×104(0.46~59μg/ml,r2=0.997),去氫鉤藤堿:y=6.38×104x–1.45×104(0.48~61μg/ml,r2=0.998),異去氫鉤藤堿:y=5.54×104x-1.86×104(0.45~58μg/ml,r2=0.998);準(zhǔn)確度實驗結(jié)果鉤藤堿低、中、高濃

9、度加樣回收率分別為103％、94.8%、113%;異鉤藤堿低、中、高濃度加樣回收率分別為88%、90%、100%;去氫鉤藤堿低、中、高濃度加樣回收率分別為92%、88%、98%;異去氫鉤藤堿低、中、高濃度加樣回收率分別為106%、113%、108%;精密度結(jié)果顯示鉤藤堿日內(nèi)精密度分別為1.76%、3.70%、7.76%;異鉤藤堿日內(nèi)精密度分別為1.07%、3.78%、6.39%;去氫鉤藤堿日內(nèi)精密度分別為2.10%、3.48%、6.39

10、%;異去氫鉤藤堿日內(nèi)精密度分別為1.62%、3.50%、9.92%;提取總堿重復(fù)性實驗鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿的含量RSD值分別為1.52%、1.97%、1.81%、1.66%,重復(fù)性好;提取總堿溶液在室溫放置1、2、3、4、5天后鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿含量RSD值分別為7.55%、8.64%、6.84%、7.87%,冷藏(4℃)的1、2、3、4、5天其含量RSD值分別為4.78%、4.6%、3.7

11、7%、2.93%,室溫和冷藏5天穩(wěn)定性均良好。
　　3.2鉤藤總堿提取工藝優(yōu)化的單因素影響研究薄層色譜法定性分析鑒別后,對幾個不同產(chǎn)地的普通鉤藤藥材進(jìn)行篩選,以鉤藤堿的產(chǎn)率為響應(yīng)值,結(jié)果顯示湖南鉤藤提取率較高,確定作為藥材基礎(chǔ)。通過以上多個單因素影響考察,綜合評價,結(jié)果以冷浸24h、80%乙醇、0.2%HCl酸化、三倍量氯仿萃取3次為最佳初提工藝。
　　3.3鉤藤總堿提取工藝正交實驗優(yōu)化研究在單因素影響確定的初提工藝基礎(chǔ)上通

12、過三因素三水平的正交實驗(L933)優(yōu)化,實驗結(jié)果顯示以物料比為1:10、提取次數(shù)為3次、超聲時間為2h作為最佳優(yōu)化條件,最后確定建立了提取率高、方法簡易可行且安全的鉤藤總堿提取工藝:物料比1:10,0.2%HCL酸化的80%乙醇冷浸24h,超聲2h提取3次,提取液回收乙醇后得到濃縮液氨水調(diào)pH10~11,三倍量氯仿萃取3次,回收,真空干燥(<80℃)。該提取工藝提取率達(dá)0.2%。
　　3.4鉤藤總堿抗焦慮作用初步藥效學(xué)研究自制鉤

13、藤總堿在設(shè)計的幾個不同的動物焦慮模型上,分別表現(xiàn)出不同程度的抗焦慮藥效,在大、小鼠高架十字迷宮實驗和小鼠期待性焦慮實驗上尤為顯著:與空白對照組比較,RTA3個劑量組大鼠OE%和OT%顯著高于空白對照組(P<0.05),與DZP陽性對照組比較,沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);空白對照組顯示出應(yīng)激性體溫升高現(xiàn)象,陽性對照組和RTA3個劑量組小鼠均未產(chǎn)生此現(xiàn)象,表現(xiàn)出抗焦慮作用。結(jié)果表明鉤藤總堿具有一定的抗焦慮藥效。
　　3.5鉤藤總堿

14、抗焦慮作用初步作用機制研究通過ELISA測定EPM干預(yù)前后大鼠腦組織中去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量,結(jié)果顯示RTA組與空白對照組相比,可使EPM大鼠腦內(nèi)NA、DA和5-HT含量產(chǎn)生顯著減少,表明RTA對焦慮后的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用,可能是其抗焦慮作用機制之一。
　　4.結(jié)論
　　4.1建立了鉤藤總堿樣品的主要有效成分(鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿)含量

15、測定的HPLC-UV分析方法,該方法檢測時間快、分離效果好,在特異性、準(zhǔn)確性、靈敏性、重現(xiàn)性等方面均可滿足鉤藤總堿測定需求。
　　4.2確定建立了提取率高、方法簡易可行且安全的鉤藤總堿提取工藝:物料比1:10,0.2%HCL酸化的80%乙醇冷浸24h,超聲2h提取3次,提取液回收乙醇后得到濃縮液氨水調(diào)pH10~11,三倍量氯仿萃取3次,回收,真空干燥(<80℃)。該提取工藝提取率達(dá)0.2%。
　　4.3鉤藤總堿在實驗設(shè)計動物