NF-κB P65沉默聯(lián)合苦參堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HeopG2凋亡和相關(guān)分子表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的:核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作為一類(lèi)具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，是抗凋亡基因表達(dá)的主要激活子，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及免疫逃生中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，由傳統(tǒng)中藥苦參中提取的活性成分苦參堿不僅能夠抑制腫瘤的擴(kuò)散，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，使其在臨床上得以廣泛應(yīng)用。我們前期的研究表明，苦參堿在體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的過(guò)程中，能同時(shí)激活NF-κB通路，利用二硫代氨

2、基甲吡咯烷抑制NF-κB活性，可增強(qiáng)苦參堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，但其具體機(jī)制尚不明了。本實(shí)驗(yàn)以人肝癌HepG2細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討NF-κB P65沉默聯(lián)合應(yīng)用苦參堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡作用及對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，以揭示抑制NF-κB通路增強(qiáng)苦參堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建NF-κB P65 siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)NF-κB

3、 P65 mRNA的表達(dá)水平，篩選出沉默效率最高的質(zhì)粒。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并篩選出NF-κB P65沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　(2)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、倍增時(shí)間測(cè)算探討NF-κB P65沉默對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞一般生物學(xué)特性的影響。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)NF-κB通路沉默聯(lián)合苦參堿應(yīng)用下的HepG2細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法和Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞NF-κB P65、CD95(

4、Fas)、Smac、Survivin的mRNA和蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1) NF-κB P65 siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并用沉默效率最高質(zhì)粒成功篩選出入肝癌HepG2細(xì)胞NF-κB P65沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　(2) NF-κκB P65沉默后處于S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，G0/G1期細(xì)胞少于對(duì)照組(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染試劑及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影響;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，NF-κ B

5、 P65沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組形成克隆數(shù)少于對(duì)照組(P＜0.05)，而對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組及陰性對(duì)照組形成的細(xì)胞克隆數(shù)無(wú)差異;同時(shí)，NF-κB P65沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組倍增時(shí)間亦長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　(3)苦參堿組NF-κB P65、CD95、Smac和Survivin的表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組CD95和Smac的表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組有差異(P＜0.05)，NF-κB P65和Surviv

6、in的表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組、苦參堿組有差異(P＜0.05);聯(lián)合組CD95和Smac的表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組、苦參堿組、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組有差異(P＜0.05)，NF-κB P65和Survivin的表達(dá)下調(diào)，與苦參堿組有差異(P＜0.05)。各組細(xì)胞凋亡率分別為3.21％、6.25％、11.82％、21.06％，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論: NF-κB P65沉默可增強(qiáng)苦參堿誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，其機(jī)制可能與