外泌體——電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的另一種機(jī)制.pdf

1、目的:首先驗(yàn)證電離輻射是否在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng);進(jìn)而探索除細(xì)胞間隙連接和可溶性分子兩種信號介導(dǎo)方式外的新的旁效應(yīng)信號介導(dǎo)機(jī)制。在文獻(xiàn)調(diào)研與預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上,探索外泌體是否為電離輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的一種介導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:采用條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移的方法,以DNA損傷、微核形成和克隆形成為指標(biāo),檢測X射線在H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的旁效應(yīng)。采用差速離心法從未輻照和輻照后的H460細(xì)胞培養(yǎng)液中提取

2、、純化外泌體,通過透射電子顯微鏡觀察其形態(tài),激光粒度儀分析粒徑分布,并用Western Blot檢測其標(biāo)志蛋白hsp90β的表達(dá)。另外,檢測不同照射劑量以及照射后不同時間點(diǎn)細(xì)胞分泌外泌體的粒徑分布。通過熒光探針共定位實(shí)驗(yàn)觀察外泌體進(jìn)入接收細(xì)胞。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測外泌體對接收細(xì)胞增殖的影響,同時檢測外泌體對接收細(xì)胞微核形成和克隆形成能力的影響。為探索外泌體中的RNA是否對引起接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)變化發(fā)揮重要作用,預(yù)先將RNA酶與外泌體孵育以

3、滅活外泌體內(nèi)RNA,去除殘留RNA酶后,將外泌體加入接收細(xì)胞中,觀察接收細(xì)胞微核形成率的變化。本研究采用Origin8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析和作圖,采用Student’s t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,當(dāng)p值小于0.05時,認(rèn)為兩比較組間的差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部數(shù)據(jù)均來源于最少三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。
　　結(jié)果:
　　1.條件培養(yǎng)液介導(dǎo)電離輻射旁效應(yīng)。相對于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉(zhuǎn)移組,將5Gy X射

4、線照射后1小時的H460細(xì)胞條件培養(yǎng)液(RCM)轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞,旁效應(yīng)細(xì)胞微核形成率增加了80％,克隆形成率降低了13％。相對于未受照射條件培養(yǎng)液(SCM)轉(zhuǎn)移組,將5Gy X射線照射后18小時的H460細(xì)胞條件培養(yǎng)液(RCM)轉(zhuǎn)移到未做任何處理的旁效應(yīng)細(xì)胞,旁效應(yīng)細(xì)胞微核形成率增加了3.5-5倍,克隆形成率降低了8.3％,DNA損傷增加了18％。并且,無論1小時還是18小時條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移,5Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)

5、液和10Gy X射線照射后的條件培養(yǎng)液產(chǎn)生的微核形成率沒有明顯差別。
　　2.外泌體的分離和鑒定。采用差速離心法,可以簡便、快速地獲得外泌體。透射電鏡下可見典型的外泌體“盤杯狀”特征,大小在30-150nm。進(jìn)一步通過Western Blot檢測普遍接受的外泌體標(biāo)志物Hsp90β,確證提取物為外泌體。不管是否受到照射,H460細(xì)胞均分泌外泌體,但是在兩種情形下細(xì)胞分泌的外泌體的粒徑分布卻完全不同。并且,細(xì)胞分泌的外泌體尺寸依賴于細(xì)

6、胞受照劑量和照射后培養(yǎng)時間。
　　3.外泌體與H460接收細(xì)胞的相互作用。將用熒光探針分別標(biāo)記的外泌體與接收細(xì)胞共培養(yǎng)30分鐘后,觀察到從未受照射和受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取的外泌體均可迅速進(jìn)入H460接收細(xì)胞中,可能是通過膜融合的方式。
　　4.從條件培養(yǎng)液提取的外泌體可誘導(dǎo)接收細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。加入從未受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體不改變接收細(xì)胞的微核形成率,然而,從受照射細(xì)胞培養(yǎng)液提取純化的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增

7、加了兩倍。用RNA酶預(yù)先除去外泌體中RNA,再將此外泌體加入接收細(xì)胞,之前觀察到的細(xì)胞受照后條件培養(yǎng)液中提取的外泌體使接收細(xì)胞的微核形成率增加的生物學(xué)效應(yīng)消失。另外,不管是否受照,與新鮮培養(yǎng)液對照組相比,H460細(xì)胞分泌的外泌體均能促進(jìn)接收細(xì)胞增殖(增加11％左右)。但是,不管是否受照,與新鮮培養(yǎng)液對照組相比H460細(xì)胞分泌的外泌體均不影響接收細(xì)胞的克隆形成率。
　　結(jié)論:
　　1.X射線可在H460細(xì)胞中誘導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)液介導(dǎo)的