神經(jīng)生長因子和NF-κB信號通路與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：通過研究NF-κB及NGF在內(nèi)異癥中的表達(dá)，旨在探討神經(jīng)生長因子（NGF）及核因子（NF-κB）信號通路在子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，Ems）發(fā)病機(jī)制中的作用及兩者間的相互關(guān)系。
　　 方法：
　　 課題第一部分：
　　 2008年1月至2009年12月收集子宮內(nèi)膜異位癥行開腹或腹腔鏡手術(shù)治療的52名患者，取一種或兩種類型異位病灶標(biāo)本共52例及32例內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜標(biāo)本作為研究對象及25

2、例同期因?qū)m頸CINII、III而要求行子宮全切患者的正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本作為對照，比較內(nèi)異癥疼痛與臨床分期的關(guān)系，采用免疫組化SP法及Western-blot檢測Ems患者異位內(nèi)膜（異位內(nèi)膜組）及在位內(nèi)膜組織（在位內(nèi)膜組）NGF、VEGF、TNF-α和NF-κB的表達(dá)，并與非Ems患者（對照組）進(jìn)行比較。
　　 課題第二部分：1）清潔級SD大鼠，共50只，隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組和A、B、C、D四組。A組：動情期建模。其余3組適應(yīng)性

3、喂養(yǎng)一周后造模。B組：造模前小劑量注射雌激素。C組：造模后第10天低劑量注射雌激素，連續(xù)5天。D組造模前24小時及造模后第10天低劑量注射雌激素，連續(xù)5天。在建模后4周處死大鼠留取子宮內(nèi)膜標(biāo)本及異位內(nèi)膜標(biāo)本，記錄異位內(nèi)膜大小、形態(tài)、顏色等，異位組織用4%多聚甲醛固定及液氮凍存。2）對各組標(biāo)本行病理學(xué)檢測，觀察異位組織中腺體的生長情況，計(jì)算模型成功率，評價比較不同建模方法模型的成功率及雌激素對大鼠內(nèi)異癥模型的作用及影響。3）比較不同時間點(diǎn)

4、異位內(nèi)膜生長情況，選擇最佳觀察時點(diǎn)。采用免疫組化SP法檢測異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜NGF、VEGF和TNF-α、NF-κB的表達(dá)，并與對照組進(jìn)行比較。
　　 課題第三部分：
　　 1）建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型（n=45）。術(shù)后4周開腹觀察大鼠內(nèi)異癥成模情況，將成模大鼠隨機(jī)分為PDTC組（pyrrolidine dithiocarbamate，P），即2次手術(shù)后3天給予PDTC腹腔注射，和生理鹽水組（physiological

5、 saline，S），即2次手術(shù)后3天給予生理鹽水注射，作為陽性對照；未成模大鼠作為陰性對照。2）術(shù)后21天處死大鼠，計(jì)算模型成功率。留取異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定或液氮凍存?zhèn)溆谩?）應(yīng)用免疫組化法測定各組大鼠異位子宮內(nèi)膜NGF、VEGF和TNF-α、NF-κB的表達(dá)，比較生理鹽水組和PDTC干預(yù)后各因子的變化。4）用Western-blot法進(jìn)行各組NGF、VEGF和TNF-α、NF-κB的表達(dá)測定并進(jìn)行比較，RT-

6、PCR測定NGF-mRNA表達(dá)，探討抑制NF-κB信號通路的激活減輕子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：1）內(nèi)異癥患者不同臨床分期各種疼痛評分比較：I-II期患者與對照組患者比較，除盆腔痛組患者疼痛評分高于對照組外（P＜0.05），其他疼痛差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。III-IV期患者疼痛總分明顯高于I-II期患者和對照組患者（P＜0.05）；2）與對照組比較，內(nèi)異癥組在位內(nèi)膜、異位

7、內(nèi)膜中NGF、TNF-α、VEGF、NF-κB蛋白的表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。TNF-α、NF-κB表達(dá)在在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在位內(nèi)膜中NGF和VEGF表達(dá)顯著高于異位內(nèi)膜（P＜0.05）。3）western-blot檢測NGF蛋白表達(dá)在異位內(nèi)膜III、IV期高于I、II期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但I(xiàn)、II期和III、IV期組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。N

8、F-κB蛋白表達(dá)除IV高于I期（P＜0.05）外，其余各組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分：1）A、B、C、D各組模型成功率分別為60%、60%、80%和90%；2）不同方法建立子宮內(nèi)膜異位癥模型異位組織大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3）免疫組化檢測顯示：A、B、C、D組NGF、TNF-α、VEGF、NF-kB表達(dá)均較對照組高（P＜0.05）。C、D組NGF、VEGF、NF-kB表達(dá)均較A、B組高（P＜0.05）。NGF、V

9、EGF、NF-kB在A、B及C、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TNF-α在C、D組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4）Western-blot檢測NGF、TNF-α、VEGF、NF-kB對照組及造模組中的表達(dá)顯示：4種不同方式造模組中各種蛋白的表達(dá)均較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組與B組比較，蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且C組與D組間比較，除VEGF蛋白的表達(dá)顯著增加外，其余蛋白表達(dá)量差異

10、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但與A、B組比較，C、D組蛋白表達(dá)量均高于A、B組（P＜0.05）。
　　 第三部分：1）PDTC組大鼠異位內(nèi)膜囊腫較生理鹽水組明顯縮小；2）與對照組比較，生理鹽水組NGF、VEGF、TNF-α和NF-κB的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。PDTC組NGF、VEGF、TNF-α和NF-κB的表達(dá)均低于生理鹽水組（P＜0.05），與對照組比較，除TNF-α外差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3）PD

11、TC處理組異位內(nèi)膜中NGFmRNA表達(dá)較生理鹽水組低（P=0.001），給予PDTC干預(yù)后背根神經(jīng)節(jié)NGF mRNA的表達(dá)與生理鹽水組及對照組比較，三組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。抑制NF-κB活性后NGF表達(dá)降低，說明NF-κB信號通路參與調(diào)控NGF的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1．本課題首次研究神經(jīng)肽NGF和NF-κB在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制及疼痛產(chǎn)生中的相互作用，結(jié)果提示NGF和NF-κB在內(nèi)異癥病人異位

12、和在位內(nèi)膜中的表達(dá)增強(qiáng)，支持了郎景和教授的“在位內(nèi)膜決定論”。
　　 2．NGF和NF-κB在內(nèi)異癥病人異位和在位內(nèi)膜中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者有協(xié)同作用。
　　 3．NGF和NF-κB表達(dá)的強(qiáng)度與疼痛程度有關(guān)，疼痛越重表達(dá)越強(qiáng)，提示兩者可能參與內(nèi)異癥疼痛。
　　 4．雌激素提高了子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的成模率，也促進(jìn)了大鼠異位內(nèi)膜中細(xì)胞因子的表達(dá)，提示雌激素是內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。
　　 5．本研究證實(shí)

13、PDTC可明顯減小內(nèi)膜異位病灶，同時降低大鼠異位灶中NGF和NGFmRNA表達(dá)，表明NF-κB信號通路參與了NGF的表達(dá)調(diào)控。
　　 6．PDTC降低大鼠異位灶中VEGF、TNF-α和NF-κB水平，提示發(fā)病早期NGF、NF-κB、TNF-α和VEGF的高表達(dá)，促進(jìn)了內(nèi)異癥的發(fā)生，NGF持續(xù)的高表達(dá)，可能在疾病的發(fā)展過程中誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的產(chǎn)生，導(dǎo)致漸進(jìn)性疼痛。也表明NF-κB在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中起著重要作用，抑制NF-κB信號通