土壤中高效解磷細(xì)菌的篩選及其發(fā)酵工藝的優(yōu)化.pdf

1、溶磷細(xì)菌（簡稱磷細(xì)菌）是一類在土壤中具有很強(qiáng)溶磷能力的細(xì)菌的總稱。磷細(xì)菌可使土壤中不能被植物利用的磷化物轉(zhuǎn)變成可被利用的可溶性磷化物，故又稱溶磷細(xì)菌。溶磷細(xì)菌主要通過生產(chǎn)各種酶或酸來發(fā)揮自己的生物特性，溶磷細(xì)菌在磷資源循環(huán)的過程中起著不可或缺的作用，由于磷細(xì)菌可以將難溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，提高作物對(duì)磷的利用率，因此在微生物肥料生產(chǎn)過程中應(yīng)用廣泛。實(shí)踐證明，磷細(xì)菌對(duì)小麥、甘薯、大豆、水稻等多種農(nóng)作物，以及蘋果、桃等果樹具有一定增產(chǎn)效果

2、。常用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的解磷細(xì)菌有解磷巨大芽孢桿菌，俗稱為“大芽孢”磷細(xì)菌，此外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用到的還有其他芽孢桿菌和無色桿菌、假單胞菌等。
　　本實(shí)驗(yàn)從作物根際土壤中分離高效解磷細(xì)菌。對(duì)于從土壤中分離到的菌株，通過平板法進(jìn)行初篩，根據(jù)解磷透明圈直徑和菌落直徑比值大小初步確定菌株解無機(jī)磷和有機(jī)磷的能力，然后通過液體搖瓶培養(yǎng)，利用鉬銻抗比色法測(cè)定發(fā)酵上清液中有效磷含量，從而進(jìn)一步確定該分離菌株的解磷能力。通過實(shí)驗(yàn)篩選出1株具有高效解有

3、機(jī)磷能力的細(xì)菌，在蛋黃培養(yǎng)基上可產(chǎn)生明顯的解磷圈，分解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，D/d比值為4，在卵磷脂液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后，發(fā)酵上清液中的有效磷達(dá)到最高值54.21mg/L，是對(duì)照組的45倍，可看出解磷效果顯著。
　　通過形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析等一系列試驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。通過篩選從作物根際土上分離得到的巨大芽孢桿菌 BM2菌株，存于實(shí)驗(yàn)室保藏。采用單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面份分析試驗(yàn)優(yōu)化了巨大芽孢桿菌菌株 BM2的最佳

4、發(fā)酵培養(yǎng)基以及最佳發(fā)酵條件。實(shí)驗(yàn)表明，巨大芽孢桿菌 BM2最適生長條件優(yōu)化該菌株的最適生長溫度為32℃，最佳生長pH為7.2。該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為豆粕粉，最佳無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀。采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析結(jié)合實(shí)際值，確定最優(yōu)的液體發(fā)酵條件為可溶性淀粉48.85g/L，豆粕19.67g/L，pH為7.2，該設(shè)計(jì)的理論芽孢數(shù)為43.16×108 cfu/mL，實(shí)際測(cè)定的芽孢數(shù)為41.29×108 cf

5、u/mL，與理論值差距很小。
　　研究確定，菌株BM2的最佳發(fā)酵溫度為34℃，最佳接種量為3％，最佳發(fā)酵時(shí)間為32h，最佳裝液量為60mL/250mL。
　　為了提高巨大芽孢桿菌 BM2的生物穩(wěn)定性，通過對(duì)其進(jìn)行固定化優(yōu)化，確定巨大芽孢桿菌BM2固定化的最佳載體和交聯(lián)劑，最佳載體為濃度為4%的海藻酸鈉，最佳交聯(lián)劑為4%的氯化鈣，包菌量在10%，交聯(lián)時(shí)間在24h時(shí)，菌株能保持其最佳活性，達(dá)到最佳效果。
　　擬南芥生根實(shí)驗(yàn)

6、中，培養(yǎng)基中添加了巨大芽孢桿菌 BM2發(fā)酵液的擬南芥幼苗的生根情況較于對(duì)照組擬南芥幼苗的根長均有明顯的增加，且觀察到，添加了發(fā)酵液培養(yǎng)基中的擬南芥?zhèn)雀^于對(duì)照組發(fā)達(dá)。通過實(shí)驗(yàn)可知該菌株發(fā)酵液濃度為23cfu/mL，將BM2發(fā)酵液500倍時(shí)，對(duì)擬南芥生根促進(jìn)效果最佳，根長相對(duì)于不加BM2菌劑的對(duì)照組增加了67.4%。稀釋倍數(shù)為50時(shí)，對(duì)擬南芥生長促進(jìn)效果最不明顯。所有稀釋倍數(shù)處理下的擬南芥根長跟對(duì)照相比差異明顯。
　　不同稀釋倍數(shù)處

7、理的巨大芽孢桿菌 BM2發(fā)酵液對(duì)黃瓜幼苗的生長都起到了促進(jìn)作用。隨著稀釋倍數(shù)的增加，對(duì)黃瓜幼苗生長的促進(jìn)作用越明顯，在500倍稀釋的發(fā)酵液處理下，與對(duì)照組相比差異顯著，黃瓜幼苗的株高提高了25%，黃瓜幼苗的鮮重比對(duì)照組提高37%，在1000倍稀釋的發(fā)酵處理下，與對(duì)照組相比差異顯著，黃瓜幼苗的株高提高了51%，黃瓜幼苗的根長比對(duì)照組提高了21%，黃瓜幼苗的鮮重比對(duì)照組提高39%。以上對(duì)比差異顯著（P<0.05）。添加發(fā)酵液的處理能夠促進(jìn)黃