舒脈膠囊對(duì)缺血心肌大鼠促血管新生及改善左室重構(gòu)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分舒脈膠囊對(duì)心肌缺血大鼠促血管新生的研究 背景： 本研究通過(guò)對(duì)心肌缺血大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)改變的觀察，通過(guò)超聲心動(dòng)圖分析左室心功能，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA的表達(dá)，以及通過(guò)Western blot檢測(cè)缺血心肌磷酸化PI3K/Akt、VEGF、PDGF-BB的蛋白表達(dá)的改變，通過(guò)免疫組化檢測(cè)缺血心肌微血管密度，探討舒脈膠囊在缺血心肌中促血管新生的作用，并探討其信

2、號(hào)調(diào)控機(jī)制，為其臨床防治缺血性心血管疾病提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)。 目的： 1.通過(guò)觀察舒脈膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及心功能改變，及對(duì)毛細(xì)血管與微動(dòng)脈的新生的影響，探討舒脈膠囊促血管新生的療效。 2.觀察舒脈膠囊對(duì)大鼠缺血心肌磷酸化PI3K、Akt蛋白表達(dá)，及VEGF、PDGF-BB的蛋白及mRNA表達(dá)影響，探討舒脈膠囊促進(jìn)穩(wěn)定而有功能的血管新生的信號(hào)調(diào)控機(jī)制。 方法： 1.研究對(duì)象

3、 建立大鼠心肌缺血實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚖istar大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為舒脈大劑量/LY294002組、舒脈小劑量組、舒脈大劑量組、貝復(fù)濟(jì)組、模型組；另設(shè)假手術(shù)組。 2.研究?jī)?nèi)容 （1）心功能檢測(cè)；（2）Western blot檢測(cè)缺血心肌VEGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)；（3）實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)缺血心肌VEGF、PDGF-BB mRNA表達(dá)；（4）檢測(cè)缺血

4、心肌微血管密度；（5）Masson染色檢測(cè)缺血心肌膠原含量的變化。 結(jié)果： 1.心功能檢測(cè) 治療第2周后，SMCH、SMCL、bFGF組的左室射血分?jǐn)?shù)較MIR組顯著增高； SMCH與SMCL、bFGF組比較差異無(wú)顯著性意義。SMCH、SMCL、bFGF組左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室舒張末期內(nèi)徑較MIR組顯著降低。 2.Western blot檢測(cè)分析 治療第2周后， SMCH、SMCL、bFGF組V

5、EGF、PDGF-BB、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)較MIR組顯著升高。 3.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 治療第2周后， SMCH組、SMCL組、bFGF組VEGF、PDGF-BB mRNA表達(dá)較MIR組顯著升高。SMCH/LY組VEGF、PDGF-BB mRNA表達(dá)與MIR組差異無(wú)顯著性意義。 4.缺血心肌微血管密度的測(cè)定 治療2周后，SMCH組、SMCL組、bFGF組的毛細(xì)血管密度均較MIR組明顯增高。

6、 5.Masson染色檢測(cè)缺血心肌膠原含量的變化 光鏡下Masson染色顯示，心肌細(xì)胞染色呈黃色，間質(zhì)膠原呈藍(lán)綠色。 結(jié)論： 1.本研究首次證明舒脈膠囊對(duì)心肌缺血大鼠具有顯著的促血管新生療效，改善MI大鼠心功能。表現(xiàn)為微血管密度的增加，心功能指標(biāo)LVEF的提高，LVESD、LVEDD降低。且舒脈膠囊的療效具有劑量依賴性。 2.與MIR組比較，舒脈膠囊單獨(dú)治療顯著提高了缺血心肌VEGF、PDGF-B

7、B的表達(dá)水平，及磷酸化PI3K、Akt蛋白的表達(dá)水平。 3.與舒脈膠囊單獨(dú)治療比較，PI3K抑制劑和舒脈膠囊聯(lián)合治療顯著抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，同時(shí)明顯抑制舒脈膠囊促VEGF、PDGF-BB的高表達(dá)，及降低舒脈膠囊促毛細(xì)血管與微動(dòng)脈新生的作用。證實(shí)舒脈膠囊促血管新生的分子機(jī)制是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)VEGF、PDGF-BB的表達(dá)、促進(jìn)VEGF、PDGF-BB介導(dǎo)的毛細(xì)血管以及穩(wěn)定的側(cè)支循環(huán)的建立。

8、 第二部分舒脈膠囊改善心肌缺血大鼠左室重構(gòu)的研究 目的： 1.通過(guò)觀察舒脈膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血心肌組織學(xué)、形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變、整體與局部心功能、α-SMA蛋白表達(dá)、及collagenⅠmRNA與蛋白表達(dá)的影響，探討舒脈膠囊減少心肌成纖維細(xì)胞增殖、降低心肌纖維化、及改善左室重構(gòu)的療效。 2.觀察舒脈膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血心肌磷酸化應(yīng)激激活細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶、TNF-α、金屬蛋白酶組織抑制因子-1蛋白表達(dá)的影

9、響，探討舒脈膠囊改善左室重構(gòu)的機(jī)制。 方法： 1.研究對(duì)象 建立大鼠心肌梗死實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚖istar大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血模型。造模方法同第一部分。造模成功的大鼠隨機(jī)分為舒脈大劑量組、舒脈小劑量組、p38MAPK抑制劑SB203580、模型組；另設(shè)假手術(shù)組。 2.研究?jī)?nèi)容 （1）超聲心動(dòng)檢測(cè)；（2）放射免疫法檢測(cè)血漿TNF-α含量；（3）Western blot檢測(cè)缺血心肌磷酸化p38

10、MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達(dá)；（4）實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)缺血心肌collagenⅠ mRNA表達(dá)；（5）免疫組化染色檢測(cè)缺血心肌collagenⅠ、α-SMA蛋白表達(dá)；（6）HE染色；（7）天狼猩紅染色檢測(cè)膠原含量的變化；（8）透射電鏡觀測(cè)心肌超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1.左心室整體與局部功能超聲心動(dòng)圖分析 在治療后第1、6周時(shí)進(jìn)行了超聲檢查。左室射血分?jǐn)?shù)是目前臨床上評(píng)價(jià)左心室整體功能最常用的指標(biāo)

11、。治療第1周后，SMCH組、SMCL組、SB組的LVEF、BW較MIR組顯著增高，而LVESD、LVEDD、LVW/BW較MIR組顯著降低。局部室壁增厚率可用來(lái)反應(yīng)心肌局部功能。治療第1周后，SMCH組、SMCL組、SB組的WT較MIR組顯著增高。 2.血漿TNF-α水平的測(cè)定 通過(guò)放免法檢測(cè)SMC的抗炎癥的作用。治療1周后，MIR組、SMCH組、SMCL組血漿TNF-α水平較Sham組明顯升高。但是，SMCH組、SMC

12、L組、SB組血漿TNF-α水平較MIR組明顯降低。 3.Western blot檢測(cè)分析 治療1周后，MIR組大鼠心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白的表達(dá)較Sham組明顯增加。SMCH、SMCL、SB組心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達(dá)較MIR組明顯減少。進(jìn)一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌組織p-p38MAPK、TNF-α、TIMP-1蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著

13、性意義。 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR 通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)大鼠心肌組織collagenⅠmRNA的表達(dá)。治療1周后，MIR組大鼠心肌組織collagenⅠmRNA的表達(dá)較Sham組明顯增加。SMCH、SMCL、SB組心肌組織collagenⅠ mRNA表達(dá)較MIR組明顯減少。進(jìn)一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌組織collagenⅠ mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性意義。 5.免疫組化染色分析

14、 5.1α-SMA表達(dá) α-平滑肌激動(dòng)蛋白是檢測(cè)CFs增殖的可靠指標(biāo)。通過(guò)免疫組化染色法可使陽(yáng)性指標(biāo)呈棕色或棕黃色染色。α-SMA主要表達(dá)于VSMC與CFs中。 5.2 CollagenⅠ表達(dá) 治療1周后，通過(guò)免疫組化檢測(cè)到MIR組心肌間質(zhì)中較Sham組明顯增多的棕褐色陽(yáng)性表達(dá)。SMCH、SMCL、SB治療組的Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)較MIR組顯著降低。進(jìn)一步兩兩比較分析，SMCH組較SMCL組或SB組心肌間質(zhì)co

15、llagenⅠ的表達(dá)無(wú)顯著性差異。 6.HE染色 Sham組大鼠心肌細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞分界較清楚，胞核大小均一，染色正常。肌纖維排列緊密整齊，壁內(nèi)小動(dòng)脈管壁及管腔正常，管周纖維組織少；MIR組大鼠心肌細(xì)胞減少，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，心肌細(xì)胞肥大，分界不清楚。肌纖維排列較紊亂，壁內(nèi)小動(dòng)脈管壁厚，管腔狹小，管周纖維組織增多。CFs大量增殖、聚集。 7.天狼猩紅染色膠原含量的變化 6周時(shí)，各組大鼠心肌纖維化面積均有

16、不同程度的提高。MIR組大鼠心肌存在廣泛的心肌纖維化，且心肌纖維化面積明顯高于1周組。 8.透射電鏡觀測(cè)心肌超微結(jié)構(gòu)變化 Sham組大鼠心肌肌原纖維排列整齊、緊密，無(wú)斷裂，肌絲清晰，細(xì)胞核發(fā)育良好，線粒體體積大數(shù)量多，嵴豐富排列緊密呈Z字型，肌漿網(wǎng)體積大，數(shù)量多，胞漿豐富。 結(jié)論： 1.舒脈膠囊對(duì)MI大鼠左室重構(gòu)有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，其具體表現(xiàn)為：改善MI大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)，降低心肌CFs增殖與ECM膠