δ-catenin和small GTP酶的協(xié)同表達與肺癌的惡性程度相關(guān).pdf

1、前言
　　 δ-catenin作為p120亞家族中的重要成員,與p120的結(jié)構(gòu)及作用相似,具有十個Arm重復(fù)序列,與p120同在細胞膜上的E-cadherin擁有共同的JMD(juxtamembrane domain)結(jié)合位點,可以通過與E-cadherin(E-cad)直接結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體,調(diào)節(jié)細胞間的粘附。同樣,δ-catenin也可以入核并與kaiso相結(jié)合。
　　 據(jù)報道,在神經(jīng)

2、元內(nèi),δ-catenin參與信號傳遞,還可以通過對SmallGTP酶(例如RhoA、Cdc42、Rac1)活性的調(diào)節(jié)來影響細胞骨架生長。SmallGTP酶是Ras超家族中的小GTP結(jié)合蛋白,它們在代謝中存在活化型(與GTP結(jié)合)和失活型(與GDP結(jié)合)兩種形態(tài),二者就像分子開關(guān)般動態(tài)調(diào)節(jié)裝配actin細胞骨架,并引發(fā)細胞的形態(tài),趨化和細胞運動等不同的生物反應(yīng)。因此,我們推測在肺癌組織中,δ-catenin與SmallGTP酶之間很可能存

3、在著聯(lián)系。
　　 在本研究中,我們對135例NSCLC樣本中δ-catenin及SmallGTP酶的表達情況進行檢測,并探討了它們的表達與臨床病理因素的關(guān)系。同時,在肺癌細胞系中分別過表達或干擾δ-catenin進而影響肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 材料與方法
　　 一、組織標本與病人資料
　　 135例具有隨訪資料的原發(fā)性肺鱗癌、腺癌(均來自1998～2005年在中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的標本

4、蠟塊)。其中71例男性,64例女性,平均年齡為58歲。根據(jù)WHO肺腫瘤組織學(xué)2004年分類標準:其中鱗癌61例,腺癌74例。高分化32例,中分化64例,低分化39例。按照International Union AgainstCancer(UICC)于2002年修訂的腫瘤pTNM分期標準:Ⅰ期22例,Ⅱ期46例,Ⅲ期59例,Ⅳ期8例。對這些病例中的70例進行了術(shù)后隨訪,生存時間是從手術(shù)日期到由于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡的日期(或木次隨訪日期)為止

5、。
　　 此外,為提取蛋白及RNA,另取30例新鮮肺癌及癌旁正常肺組織。
　　 二、免疫組織化學(xué)染色
　　 對135例NSCLC標本采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫組織化學(xué)方法,檢測δ-catenin與SmallGTP酶的表達及其與各臨床病理因素之間的關(guān)系,及70例隨訪標本中δ-catenin與SmallGTP酶的表達與患者預(yù)后的關(guān)系。觀察δ-catenin在腫瘤組織的表達,計數(shù)40

6、0個腫瘤細胞并計算其中陽性染色細胞的百分數(shù)。δ-catenin的評分標準:免疫染色的強度(0=negative,1=weak,2=moderate,3=strong)；免疫染色的陽性腫瘤細胞數(shù)(0=absent,1=1～25％,2=26～50％,3=51～75％,4=≥76％)。最終分數(shù)即為兩項評分的乘積。為了便于統(tǒng)計,將評分結(jié)果分為兩組:陰性表達<2；陽性表達≥2。對SmallGTP酶進行免疫組化檢測,每張切片隨機選取5個高倍視野,每

7、個視野計數(shù)100個瘤細胞,RhoA、Cdc42和Rac1胞漿表達(-)～(+)定義為表達正常,將(++)～(+++)定義為過度表達。將δ-catenin陽性表達和smallGTP酶的過表達同時出現(xiàn)的情況,稱為協(xié)同表達。
　　 三、細胞培養(yǎng),質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　 人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、SPC-A-1(Manassas,VA,USA),分別培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清,2.3g/L NaHC03、100U/ml青鏈霉素的RP

8、MI 1640或高糖DMEM(GBIC0Inc.,Los Angeles,CA,USA)培養(yǎng)液中。
　　 (1)δ-catenin cDNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:含人源性全長δ-catenin cDNA的質(zhì)粒(pCMV5-FLAG/δ-catenin),用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)導(dǎo)入δ-catenin表達較低的SPC細胞系,并以空載體作為陰性對照。
　　 (2)δ-cateni

9、n siRNA質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染:將設(shè)計的δ-catenin siRNA(5’-CUACGUUGACUUCUACUCAUU-3’;5’-UGAGUAGAAGUCAACGUAGUU-3’),利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000導(dǎo)入δ-catenin表達較高的A549細胞系,同時以非特異性的亂序siRNA作為陰性對照。
　　 四、Western Blotting與RT-PCR
　　 應(yīng)用Western Blotting

10、與RT-PCR檢測肺癌及癌旁正常肺組織中δ-catenin與SmallGTP酶的蛋白和mRNA表達情況。
　　 五、RhoA.Cdc42和Racl活性的檢測
　　 在過表達或敲除δ-catenin肺癌細胞系中,通過Pull-Down和比色法測定small GTPases(RhoA、Cdc42、Rac1)活性的變化。
　　 六、細胞侵襲能力的測定
　　 通過基質(zhì)膠侵襲試驗分別檢測過表達與敲除δ-cateni

11、n后的細胞侵襲能力。
　　 結(jié)果
　　 一、肺癌組織中,δ-catenin的陽性表達與RhoA、Cdc42和Rao1的過表達有較好的一致性和相關(guān)性
　　 在135例非小細胞肺癌病例中,δ-catenin陽性表達為86例,陰性表達為49例,陽性表達率為63.70％(86/135);RhoA、Cdc42和Rac1在肺癌組織中的表達明顯增強,其過表達率分別為63.70％(86/135),67.41％(91/135)和6

12、5.19％(88/135)。并且它們的過表達與δ-catenin的陽性表達具有較好的相關(guān)性(P<0.001;P<0.001;P<0.001)。分析這四種指標同時出現(xiàn)陽性表達或過表達(協(xié)同表達)與臨床病理因素的關(guān)系后發(fā)現(xiàn):肺腺癌中的協(xié)同表達率為52.70％(39/74),明顯高于于鱗癌的34.43％(21/61)(P<0.05)；Ⅲ-Ⅳ期的協(xié)同表達率為58.21％(39/67),顯著高于Ⅰ-Ⅱ期的30.88％(21/68)(P<0.05)

13、；有LN轉(zhuǎn)移的病例協(xié)同表達率是52.75％(48/91),也明顯高于無LN轉(zhuǎn)移病例的27.27％(12/44)(P<0.05)。但研究中未發(fā)現(xiàn)協(xié)同表達與患者年齡、性別和分化程度有明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。
　　 二、δ-catenin的陽性表達和RhoA、Cdc42和Rac1的過表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)
　　 當δ-catenin的陽性表達和RhoA、Cdc42和Rac1過表達時,患者的平均生存時間和5年生存率明顯低于它

14、們在正常表達時患者的平均生存時間和5年生存率(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,)。因而,δ-catenin的陽性表達和RhoA、Cdc42和Rac1的過表達與患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)。
　　 三、與正常肺組織中相比,肺癌組織中δ-catenin和SmallGTP酶的表達明顯增強
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:δ-catenin、RhoA、Cdc42和Rac在癌旁正常肺組織中正常表達,而在肺癌組織中表達

15、明顯增強。
　　 Western Blot結(jié)果支持了我們在RT-PCR中結(jié)果,在肺癌組織中δ-catenin的表達明顯增強,而RhoA,Cdc42和Rac1的表達也明顯增強。
　　 四、過表達δ-catenin使RhoA活性降低的同時升高了Cdc42和Rac1的活性；而沉默δ-catenin后則產(chǎn)生相反的影響
　　 我們分別檢測了過表達與沉默δ-catenin后RhoA、Cdc42、Rac1的活性變化。顯示在SP

16、C細胞系過表達δ-catenin后,總Cdc42和Rac1蛋白水平雖然沒有變化,但pull-down檢測顯示Cdc42/Rac1活性卻明顯增高(P<0.05),且G-LISA分析顯示RhoA活性明顯下降(P<0.001)；在A549細胞系中沉默δ-catenin后,總Cdc42和Rac1蛋白雖然也沒變化,但GTP-Cdc42/Rac1卻顯著降低(P<0.05),RhoA活性增加(P<0.05)。
　　 五、過表達δ-cateni

17、n促進肺癌細胞的侵襲,而δ-catenin的下調(diào)則抑制侵襲
　　 利用血清刺激的基質(zhì)膠侵襲實驗檢測體外過表達或沉默δ-catenin后肺癌細胞侵襲能力的變化。過表達δ-catenin后,平均侵襲的細胞數(shù)明顯高于對照組；而在沉默δ-catenin后,平均侵襲的細胞數(shù)顯著低于相應(yīng)對照組。以上數(shù)據(jù)揭示了δ-catenin的上調(diào)可以促進肺癌細胞侵襲能力；而內(nèi)源性δ-catenin的下調(diào)則明顯抑制腫瘤細胞侵襲能力。
　　 結(jié)論