PP2A調(diào)控大斑剛毛座腔菌生長發(fā)育的機(jī)制及其與TOR途徑的關(guān)系研究.pdf

1、TOR是雷帕霉素的作用靶標(biāo)，在絲狀真菌中，TOR通過激活蛋白激酶的活性以及抑制蛋白磷酸酯酶的活性，使一些下游的效應(yīng)物磷酸化，進(jìn)而達(dá)到對(duì)細(xì)胞生長所需要的一些營養(yǎng)物質(zhì)代謝的調(diào)控，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長的調(diào)控作用。PP2A參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程，PP2A通過終止參與各種磷酸化的過程來阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂時(shí)期。對(duì)PP2A的調(diào)控是TOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一個(gè)重要機(jī)制。TOR的許多下游效應(yīng)物，在經(jīng)過雷帕霉素處理后，會(huì)迅速發(fā)生去磷

2、酸化作用，這些去磷酸化的過程就依靠PP2A和SIT4來完成。大斑剛毛座腔菌（Setosphaeia turcica，俗稱玉米大斑病菌）是引起玉米大斑病的致病菌，嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)安全。本研究利用前期已經(jīng)獲得的StPP2A-C缺失突變體，對(duì)其附著胞膨壓、糖原、甘油含量等方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并通過qRT-PCR方法對(duì)其轉(zhuǎn)錄組的部分差異基因進(jìn)行了驗(yàn)證，對(duì)PP2A調(diào)控病菌生長發(fā)育的機(jī)制進(jìn)行了深入探索;利用雷帕霉素對(duì)大斑病菌野生型(WT)與PP2A

3、-C缺失突變體(H5)處理后，通過菌株的菌落形態(tài)、菌絲生長以及形態(tài)、分生孢子產(chǎn)量、附著胞形成以及穿透、TOR通路關(guān)鍵基因與PP2A基因表達(dá)量的測(cè)定，細(xì)胞自噬的觀察以及細(xì)胞自噬基因表達(dá)量的測(cè)定等來明確雷帕霉素對(duì)大斑病菌的影響，并明確PP2A與TOR通路的關(guān)系以及PP2A與細(xì)胞自噬的關(guān)系。同時(shí)，還對(duì)PP2A-C基因進(jìn)行了原核表達(dá)，并將其蛋白純化，為調(diào)取互作蛋白作準(zhǔn)備。并且對(duì)PP2A-C缺失突變體做了進(jìn)一步分析，主要結(jié)果如下:
　　1.

4、對(duì)不同碳氮源的察氏培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基上WT與H5的生長情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)H5在PDA上生長明顯比WT慢，而在察氏培養(yǎng)基上H5與WT生長速率幾乎相同，甚至比野生型快。
　　2。對(duì)WT以及H5附著胞分析顯示，H5的膨壓比WT中低，在4.5MPa左右，而WT的膨壓則在5.4MPa左右。但是，H5的甘油含量比WT中多，H5的甘油含量為62.5μmol/mL，WT的甘油含量為25.5μmol/mL。通過糖原染色觀察發(fā)現(xiàn)WT的糖原含量比H

5、5中高。
　　3。對(duì)轉(zhuǎn)錄組中WT與H5的差異基因進(jìn)行了初步分析，共找到了286個(gè)差異基因，其中165個(gè)上調(diào)，121個(gè)下調(diào)，并且通過qRT-PCR方法對(duì)部分差異基因與效應(yīng)因子進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果正確。并且發(fā)現(xiàn)了兩條與糖代謝有關(guān)的代謝通路。
　　4.雷帕霉素處理大斑病菌，能夠抑制病菌菌落生長，隨著雷帕霉素濃度的升高，對(duì)菌株的抑制效果越明顯。并且產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)、附著胞產(chǎn)生以及附著胞穿透情況都受到明顯抑制，PP2A-C的缺失使菌株

6、對(duì)雷帕霉素更為敏感，所以受到的抑制作用更強(qiáng)。
　　5.雷帕霉素處理后，菌絲體會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞自噬現(xiàn)象。正常情況下，WT的自噬現(xiàn)象比H5中稍微明顯，但是在雷帕霉素處理后，H5中的細(xì)胞自噬現(xiàn)象卻比WT中更為明顯。
　　6.構(gòu)建了StPP2A-C與StTAP42的酵母雙雜交載體，并用酵母雙雜交驗(yàn)證了StPP2A-C與stTAP42的互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們確實(shí)存在互作。
　　7.構(gòu)建了StPP2A-C原核表達(dá)載體，并且對(duì)StPP2A-C

7、進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得較純的StPP2A-C蛋白，為后續(xù)調(diào)取PP2A-C的互作蛋白提供了依據(jù)。
　　8.構(gòu)建了StPP2A-B的敲除載體并初步獲得兩株轉(zhuǎn)化子，為后續(xù)繼續(xù)研究PP2A功能提供了基礎(chǔ)。同時(shí)本研究還構(gòu)建了StPP2A-B基因的RNAi沉默載體。
　　綜上所述，PP2A可以通過影響病菌菌絲的生長、影響附著胞膨壓的降低、附著胞內(nèi)甘油含量從而影響大斑病菌的生長發(fā)育。雷帕霉素處理能夠影響病菌的生長發(fā)育，尤其是PP2A-C敲除