菠菜硝酸鹽積累差異的生理特征與關(guān)鍵基因篩選.pdf

1、菠菜是重要的世界性葉用蔬菜，然而菠菜極易積累硝酸鹽。硝酸鹽的大量積累會(huì)降低菠菜的衛(wèi)生品質(zhì)，增加人體罹患高鐵血紅蛋白癥和消化道癌的風(fēng)險(xiǎn)。為揭示菠菜硝酸鹽積累規(guī)律，控制菠菜硝酸鹽積累水平，本研究以前期篩選的硝酸鹽含量差異顯著的4份菠菜材料為研究對(duì)象，在兩種硝態(tài)氮（NO3--N）濃度水平下，比較菠菜硝酸鹽積累差異的生理特征，揭示影響基因型間硝酸鹽積累差異的可能生理原因，并根據(jù)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（nitrate transporters，NRTs）

2、及同化酶基因的表達(dá)模式，從轉(zhuǎn)錄水平上分析和篩選與菠菜硝酸鹽積累性狀密切相關(guān)的候選基因。同時(shí)，分析不同環(huán)境處理（噴施谷氨酰胺、高溫、弱光）對(duì)菠菜硝酸鹽積累及相關(guān)基因表達(dá)模式的影響，揭示環(huán)境因素影響菠菜硝酸鹽積累的可能分子機(jī)制。最后，克隆了4個(gè)可能與菠菜硝酸鹽積累有關(guān)的SoNRT1s基因CDS全長(zhǎng)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。具體結(jié)果如下：
　　1.采用高、低硝態(tài)氮濃度（0.5mM、15mM）水培試驗(yàn)，比較了4個(gè)菠菜基因型（S10、S13、

3、S18、S57）硝酸鹽含量、NO3--N吸收能力、同化酶活性及其它氮素利用指標(biāo)的差異，結(jié)果表明，低氮處理下 S18硝酸鹽含量與 S13差異不顯著，兩者硝酸鹽含量均顯著高于S57，S10硝酸鹽含量最低。高氮處理下S13硝酸鹽含量最高，其次是S18，S10與S57硝酸鹽含量最低。S13的15NO3--N吸收效率在高、低硝態(tài)氮濃度水平下均高于其它基因型，而其氮素生理利用效率（NutE）、氮素利用效率指數(shù)（NUR）顯著低于S18和S57；S18

4、和S57的地上部分干質(zhì)量、硝酸還原酶活性、NutE、NUR顯著高于S13和S10，而15NO3--N吸收速率低于S13；S10地上部分干質(zhì)量、硝酸還原酶活性、NutE、NUR顯著低于S18和S57，15NO3--N吸收速率及氮素吸收效率顯著低于S13。供試材料中S57在高、低氮濃度下均具有較高的NutE和較低的硝酸鹽含量，可用于菠菜高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種選育。
　　2.不同硝態(tài)氮濃度水培條件下，2個(gè)菠菜材料（S10、S18）硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和

5、氮素同化酶基因的表達(dá)模式分析表明，SoNRT1.1a/b、SoNRT1.5a/b/c、SoNRT2、SoNIA、SoGS1基因主要在菠菜根中表達(dá)，SoNRT1.4、SoNRT1.6、SoNRT1.9a/b、SoGS2基因主要在菠菜地上部位表達(dá)，SoNRT1.2、SoNRT1.3基因無明顯的組織表達(dá)特異性。供試基因在菠菜S18中的表達(dá)水平普遍高于S10。與低氮處理相比，高氮下供試基因的表達(dá)在處理的個(gè)別時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)上調(diào)，多數(shù)基因表達(dá)上調(diào)的幅度

6、達(dá)到幾倍至幾十倍，S18葉片中SoNRT1.1b、SoNRT1.5a、SoNRT1.5c基因及S10根中SoNRT1.3基因上調(diào)達(dá)一千倍以上，S18葉片中SoNRT1.4基因的表達(dá)上調(diào)幅度接近一萬倍。菠菜葉片硝酸鹽含量與 SoNRT1.1b、SoNRT1.2、SoNRT1.5c、SoNRT1.9b的表達(dá)水平呈中度相關(guān)；葉柄硝酸鹽含量與SoNIA、SoGS1基因的表達(dá)中度相關(guān)。
　　3.比較噴施谷氨酰胺（Gln）（70 mg/L）、

7、高溫（36℃）、弱光（10μmol/m2/s）處理1 h和24 h對(duì)菠菜硝酸鹽含量及 SoNRT1.1a/b、SoNRT1.2、SoNRT1.3、SoNRT1.4、SoNRT1.6、SoNRT1.5c、SoNRT2、SoAS、SoNIA、SoNIR、SoGS1/2、SoNADH-GOGAT、SoFd-GOGAT基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：噴施谷氨酰胺和高溫處理短暫降低了菠菜的硝酸鹽含量，處理24 h時(shí)硝酸鹽含量又恢復(fù)至對(duì)照水平；弱光則顯著

8、提高了菠菜地上部位硝酸鹽的積累。各處理下菠菜根部多數(shù)SoNRTs基因的表達(dá)受到持續(xù)抑制，而SoNRT1.2、SoNRT1.3在弱光處理下表達(dá)水平先降低后小幅度升高，SoNRT1.3、SoNRT1.4、SoNRT2在Gln處理24 h時(shí)表達(dá)量顯著升高，SoNRT1.2、SoNRT1.6、SoNRT1.5c在高溫處理24 h時(shí)不同程度上調(diào)。弱光和Gln處理降低了菠菜地上部位大部分SoNRT基因的表達(dá)水平，而高溫處理下菠菜地上部位大部分 So

9、NRTs基因表達(dá)豐度升高，此外 SoNRT1.1a和SoNRT1.2表達(dá)量分別在Gln處理1 h時(shí)和弱光處理24 h時(shí)顯著上調(diào)。除1 h熱處理外，其它處理下菠菜地上部位大部分氮同化酶基因的表達(dá)下調(diào)，外施 Gln對(duì)SoFd-GOGAT、SoGS1、SoNIA的表達(dá)影響不大。
　　4.對(duì)不同處理下篩選到的11個(gè)候選基因進(jìn)行克隆，成功克隆到4個(gè)SoNRTs序列（SoNRT1.1a、SoNRT1.3、SoNRT1.5c、SoNRT1.9b