膠質(zhì)瘤分化的基因芯片分析及核孤兒受體功能探討.pdf

1、誘導(dǎo)分化是近年來(lái)腫瘤治療領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。維甲酸是最早確認(rèn)對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病有誘導(dǎo)分化作用的誘導(dǎo)分化劑，在臨床廣泛應(yīng)用于白血病的治療。隨后又發(fā)現(xiàn)了一系列對(duì)血液腫瘤有誘導(dǎo)分化作用的誘導(dǎo)分化劑。90年代后，誘導(dǎo)分化治療的研究由單純血液病擴(kuò)展到了實(shí)體瘤。但由于實(shí)體瘤在組織結(jié)構(gòu)和腫瘤生物學(xué)特性上更為復(fù)雜，且大都缺乏理想的特異性分化標(biāo)志，目前有關(guān)研究和應(yīng)用相對(duì)較少。
　　 本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一種常見(jiàn)的生物毒素--霍亂毒素( C

2、holeratoxin)對(duì)膠質(zhì)瘤有誘導(dǎo)分化作用。Cholera toxin(10 ng/ml)處理大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株及原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出明顯的分化特征:細(xì)胞伸展變扁，胞體變大，胞核變小，核漿比減小，突起增多而且細(xì)長(zhǎng)。同時(shí)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)增加、核增值抗原(PCNA)表達(dá)降低，流式細(xì)胞術(shù)分析提示細(xì)胞群有G1期阻滯、

3、S期細(xì)胞減少，且無(wú)明顯細(xì)胞凋亡和死亡。
　　 為進(jìn)一步了解誘導(dǎo)分化過(guò)程中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的基因表型變化始末，以及隨之而來(lái)的蛋白質(zhì)合成及功能的變化，從而能找到更多的切入點(diǎn)以加強(qiáng)或輔助誘導(dǎo)分化療法來(lái)治療惡性膠質(zhì)瘤，對(duì)Cholera toxin誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的全過(guò)程進(jìn)行了基因芯片表達(dá)譜分析。在芯片分析基礎(chǔ)上，選擇了在誘導(dǎo)分化初期即有明顯差異表達(dá)的核孤兒受體家族(NR4As)2個(gè)成員:NR4Al(NLJR77)、NR4A3(NOR1)進(jìn)行

4、功能學(xué)研究。利用SiRNA技術(shù)和質(zhì)粒過(guò)表達(dá)，觀察了NR4As缺失及過(guò)表達(dá)情況下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的分化狀態(tài)。為進(jìn)一步闡明NR4As的作用機(jī)制，構(gòu)建了NORl誘餌基因真核表達(dá)質(zhì)粒，利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)，尋找并驗(yàn)證能與其相互作用的蛋白質(zhì)因子，并初步探明了NORl與其作用輔助因子SNF5的作用結(jié)合部位。
　　 第一章霍亂毒素誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)譜研究
　　 方法:從Cholera toxin誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后3、

5、6、12、24、48h的樣品總RNA中分離得到總mRNA，進(jìn)行cDNA array芯片分析。
　　 結(jié)果:在420105*的31043個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)中，與未發(fā)生分化的C6細(xì)胞相比，誘導(dǎo)分化的3、6、12、24和48小時(shí)，mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)有明顯差異的基因數(shù)量分別為:61/123、149/192、266/247、682/491、506/291(上調(diào)<2倍/下調(diào)<2倍)；在觀察全過(guò)程(48h)持續(xù)差異表達(dá)的基因數(shù)量為:22/7，

6、其中在早期(≤12h)持續(xù)有差異表達(dá)的基因數(shù)量為28/18。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，進(jìn)行初步分類，建立了初步的誘導(dǎo)分化相關(guān)基因表達(dá)譜。
　　 結(jié)論:
　　 1.隨著分化的進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的基因由少到多，最后呈爆發(fā)形勢(shì)，說(shuō)明從最初的少數(shù)基因變化到后期，是一個(gè)級(jí)聯(lián)放大、互為因果的過(guò)程。
　　 2.在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增值周期的調(diào)節(jié)因子如cyclin D，CDK2表達(dá)下降，促膠質(zhì)瘤因

7、子PDGF表達(dá)下調(diào)；TGF-β、Integrins等協(xié)調(diào)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的因子發(fā)生上調(diào)，與分化特征相一致。
　　 第二章核孤兒受體NR4A1，NR4A3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞分化中的作用
　　 Cholera toxin誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6的分化過(guò)程中，在芯片數(shù)據(jù)上顯示NR4A1、NR4A3在早期(3h)時(shí)即有明顯升高，且此變化貫穿檢驗(yàn)的全部時(shí)程，提示NR4A1、NR4A3在C6分化過(guò)程中快速反應(yīng)，表現(xiàn)活躍，有可能參與了分化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。

8、
　　 方法:大鼠C6細(xì)胞株培養(yǎng)；相差顯微鏡術(shù)觀察細(xì)胞形態(tài)；siNUR77轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，pCMV-Entry Vector(C-terminal Myc-Flag tag)過(guò)表達(dá)NUR77； RT-PCR、Western blotting分別檢測(cè)NUR77、GFAP、PCNA蛋白水平，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期改變。激光共聚焦顯微技術(shù)觀察誘導(dǎo)分化后NOR1的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。
　　 結(jié)果:mRNA和蛋白水平檢測(cè)表明，

9、NOR1和NUR77在C6細(xì)胞誘導(dǎo)分化初始便呈明顯上調(diào)表達(dá)，與芯片結(jié)果一致。SiNUR77可以在一定程度上取消Cholera toxin誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的作用；過(guò)表達(dá)NUR77使得C6膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生一定的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期改變，與Cholera toxin誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6分化作用相類似。Cholera toxin誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6過(guò)程中，NOR1在核內(nèi)高表達(dá)且濃集，并沒(méi)有移位出核。
　　 結(jié)論:NR4As家族成員:N

10、R4A1(NUR77)，NR4A3(NORl)在Cholera toxin誘導(dǎo)分化膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中起到了重要作用，此作用可能與其核內(nèi)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，而非誘導(dǎo)凋亡。
　　 第三章NOR1轉(zhuǎn)錄輔助因子的篩選和確認(rèn)
　　 方法:利用NOR1功能域結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了2個(gè)誘餌基因片段并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)在小鼠胎腦cDNA文庫(kù)中尋找能與Norl起作用的蛋白因子。并設(shè)計(jì)了一系列的NOR1截短體序列，以確

11、定NOR1與其輔助因子的作用結(jié)合部位。
　　 結(jié)果:根據(jù)NOR1功能域結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)2條誘餌(bait)并構(gòu)建融合質(zhì)粒，其中pGB-2N2沒(méi)有自激活作用。利用其在小鼠胎腦cDNA文庫(kù)中進(jìn)行篩庫(kù)，得到2條陽(yáng)性序列的獵物( prey)基因，分別為L(zhǎng)CK和SNF5(SMARCBl)；共轉(zhuǎn)染證實(shí)SNF5與NOR1有蛋白質(zhì)相互作用。系列截短體與SNF5的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，證明與SNF5結(jié)合的部位為NOR1的DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding d