膠質(zhì)瘤分化的基因芯片分析及核孤兒受體功能探討.pdf

1、誘導分化是近年來腫瘤治療領域研究熱點之一。維甲酸是最早確認對急性早幼粒細胞白血病有誘導分化作用的誘導分化劑，在臨床廣泛應用于白血病的治療。隨后又發(fā)現(xiàn)了一系列對血液腫瘤有誘導分化作用的誘導分化劑。90年代后，誘導分化治療的研究由單純血液病擴展到了實體瘤。但由于實體瘤在組織結(jié)構和腫瘤生物學特性上更為復雜，且大都缺乏理想的特異性分化標志，目前有關研究和應用相對較少。
　　 本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，一種常見的生物毒素--霍亂毒素( C

2、holeratoxin)對膠質(zhì)瘤有誘導分化作用。Cholera toxin(10 ng/ml)處理大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞株及原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細胞后，膠質(zhì)瘤細胞增殖能力明顯受到抑制，細胞形態(tài)表現(xiàn)出明顯的分化特征:細胞伸展變扁，胞體變大，胞核變小，核漿比減小，突起增多而且細長。同時檢測膠質(zhì)瘤細胞的生長和分化以及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達增加、核增值抗原(PCNA)表達降低，流式細胞術分析提示細胞群有G1期阻滯、

3、S期細胞減少，且無明顯細胞凋亡和死亡。
　　 為進一步了解誘導分化過程中膠質(zhì)瘤細胞的基因表型變化始末，以及隨之而來的蛋白質(zhì)合成及功能的變化，從而能找到更多的切入點以加強或輔助誘導分化療法來治療惡性膠質(zhì)瘤，對Cholera toxin誘導分化膠質(zhì)瘤細胞的全過程進行了基因芯片表達譜分析。在芯片分析基礎上，選擇了在誘導分化初期即有明顯差異表達的核孤兒受體家族(NR4As)2個成員:NR4Al(NLJR77)、NR4A3(NOR1)進行

4、功能學研究。利用SiRNA技術和質(zhì)粒過表達，觀察了NR4As缺失及過表達情況下，膠質(zhì)瘤細胞C6的分化狀態(tài)。為進一步闡明NR4As的作用機制，構建了NORl誘餌基因真核表達質(zhì)粒，利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術，尋找并驗證能與其相互作用的蛋白質(zhì)因子，并初步探明了NORl與其作用輔助因子SNF5的作用結(jié)合部位。
　　 第一章霍亂毒素誘導分化膠質(zhì)瘤細胞相關基因表達譜研究
　　 方法:從Cholera toxin誘導前、誘導后3、

5、6、12、24、48h的樣品總RNA中分離得到總mRNA，進行cDNA array芯片分析。
　　 結(jié)果:在420105*的31043個基因的表達數(shù)據(jù)中，與未發(fā)生分化的C6細胞相比，誘導分化的3、6、12、24和48小時，mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達有明顯差異的基因數(shù)量分別為:61/123、149/192、266/247、682/491、506/291(上調(diào)<2倍/下調(diào)<2倍)；在觀察全過程(48h)持續(xù)差異表達的基因數(shù)量為:22/7，

6、其中在早期(≤12h)持續(xù)有差異表達的基因數(shù)量為28/18。對這些差異表達基因進行生物信息學數(shù)據(jù)庫檢索，進行初步分類，建立了初步的誘導分化相關基因表達譜。
　　 結(jié)論:
　　 1.隨著分化的進行，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的基因由少到多，最后呈爆發(fā)形勢，說明從最初的少數(shù)基因變化到后期，是一個級聯(lián)放大、互為因果的過程。
　　 2.在誘導分化過程中，促進細胞進入增值周期的調(diào)節(jié)因子如cyclin D，CDK2表達下降，促膠質(zhì)瘤因

7、子PDGF表達下調(diào)；TGF-β、Integrins等協(xié)調(diào)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的因子發(fā)生上調(diào)，與分化特征相一致。
　　 第二章核孤兒受體NR4A1，NR4A3在膠質(zhì)瘤細胞分化中的作用
　　 Cholera toxin誘導膠質(zhì)瘤細胞株C6的分化過程中，在芯片數(shù)據(jù)上顯示NR4A1、NR4A3在早期(3h)時即有明顯升高，且此變化貫穿檢驗的全部時程，提示NR4A1、NR4A3在C6分化過程中快速反應，表現(xiàn)活躍，有可能參與了分化的始動環(huán)節(jié)。

8、
　　 方法:大鼠C6細胞株培養(yǎng)；相差顯微鏡術觀察細胞形態(tài)；siNUR77轉(zhuǎn)染細胞并檢測轉(zhuǎn)染率，pCMV-Entry Vector(C-terminal Myc-Flag tag)過表達NUR77； RT-PCR、Western blotting分別檢測NUR77、GFAP、PCNA蛋白水平，流式細胞術分析細胞周期改變。激光共聚焦顯微技術觀察誘導分化后NOR1的表達和亞細胞定位。
　　 結(jié)果:mRNA和蛋白水平檢測表明，

9、NOR1和NUR77在C6細胞誘導分化初始便呈明顯上調(diào)表達，與芯片結(jié)果一致。SiNUR77可以在一定程度上取消Cholera toxin誘導分化膠質(zhì)瘤細胞C6的作用；過表達NUR77使得C6膠質(zhì)細胞發(fā)生一定的形態(tài)學和細胞周期改變，與Cholera toxin誘導分化膠質(zhì)瘤細胞C6分化作用相類似。Cholera toxin誘導分化膠質(zhì)瘤細胞C6過程中，NOR1在核內(nèi)高表達且濃集，并沒有移位出核。
　　 結(jié)論:NR4As家族成員:N

10、R4A1(NUR77)，NR4A3(NORl)在Cholera toxin誘導分化膠質(zhì)瘤細胞C6中起到了重要作用，此作用可能與其核內(nèi)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄相關，而非誘導凋亡。
　　 第三章NOR1轉(zhuǎn)錄輔助因子的篩選和確認
　　 方法:利用NOR1功能域結(jié)構，設計了2個誘餌基因片段并構建真核表達質(zhì)粒，通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術在小鼠胎腦cDNA文庫中尋找能與Norl起作用的蛋白因子。并設計了一系列的NOR1截短體序列，以確

11、定NOR1與其輔助因子的作用結(jié)合部位。
　　 結(jié)果:根據(jù)NOR1功能域結(jié)構設計2條誘餌(bait)并構建融合質(zhì)粒，其中pGB-2N2沒有自激活作用。利用其在小鼠胎腦cDNA文庫中進行篩庫，得到2條陽性序列的獵物( prey)基因，分別為LCK和SNF5(SMARCBl)；共轉(zhuǎn)染證實SNF5與NOR1有蛋白質(zhì)相互作用。系列截短體與SNF5的酵母雙雜交實驗，證明與SNF5結(jié)合的部位為NOR1的DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding d