ICSI技術(shù)挽救GFP兔及介導(dǎo)家兔轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號：S14636學(xué)位論文ICSl技術(shù)挽救GFP兔及介導(dǎo)家兔轉(zhuǎn)基因的研究指導(dǎo)教師姓名：申請學(xué)位級別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：李和平李善剛碩士周小梅教授東北林業(yè)大學(xué)副教授上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014年4月東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖一’論文答辯日期：2014年6月8日授予學(xué)位日期：答辯委員會主席：論文評閱人：聾j厶櫛素大擎摘要摘要目的探索電刺激家兔卵母細(xì)胞對ICSI過程卵的激活和胚胎發(fā)育效果的影響，檢驗從

2、死亡G即兔獲得精子通過ICSI方法能否生產(chǎn)整期發(fā)育的家兔，并對堿處理精子進(jìn)行家兔ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行初步研究。方法精子從死亡大約5小時后的雜合子G矸，公兔收集并凍存(5個月大)，通過解凍后用于ICSI。成熟的新西蘭兔通過注射HCG使其超數(shù)排卵，收集14—15小時的卵母細(xì)胞。采用顯微單精子注射技術(shù)，把精子注入卵母細(xì)胞卵質(zhì)。在IcSI操作之前或之后卵的激活采用直流電動脈沖程序。ICsI后，受精卵在B2液培養(yǎng)4天或在2—4細(xì)胞時期移植到受體

3、的輸卵管內(nèi)。此外，實驗采用10mMNaOH堿處理家兔精子使精予破膜后，與外源基因共同孵育，然后通過ICSI技術(shù)導(dǎo)入卵母細(xì)胞。實驗另設(shè)無堿處理無質(zhì)粒孵育組和堿處理后精子無質(zhì)粒孵育空白組，觀察并比較胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果ICSI前一次電擊組和前兩次電擊組囊胚率沒有顯著性差異(34％vS37％)，但這兩組囊胚率顯著高于其他組，而且ICSI前一次電擊組平均23％的囊胚表達(dá)GFP熒光一遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他組。在這兩個IcsI空白對照組，注射前兩次電擊組卵的

4、孤雌發(fā)育更高(40VS0％，尸005)。同時，注射前～次電擊加注射后一次電擊組和注射后一次電擊組胚胎的存活率顯著下降(48％和47％)。最后來自注射前一次電擊組的93枚胚胎移植給4個受體，有一個受體懷孕，而且得到整期發(fā)育的胎兒。另外，實驗結(jié)果顯示精子堿處理與質(zhì)粒孵育對胚胎的發(fā)育無顯著影響(乃005)，ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因后觀察囊胚出現(xiàn)綠色熒光，占總囊胚數(shù)的3478％，外源性DNA的轉(zhuǎn)入率為195l％。結(jié)論本實驗證實了注射前～次電擊是激活卵