SLC6A20及GCKR基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、第一部分SLC6A20基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:
　　明確SLC6A20(solutecarderfamily6,member20;可溶性載體家族6,成員20)基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。
　　方法:
　　首先采用前瞻性隊列研究設(shè)計,人群來自荷蘭鹿特丹研究(n=5974),分析SLC6A20基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。第二步選取鹿特丹研究中與2型糖尿病

2、發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的位點,采用病例-對照研究設(shè)計在另一個獨立的荷蘭人群中對其與2型糖尿病的關(guān)系進(jìn)行驗證。病例組來自荷蘭埃菌霍溫糖尿病研究(n=1472),對照組來自鹿特丹研究2000年延長隊列的非糖尿病受試者(n=1661)。第三步選取荷蘭病例-對照研究中與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的位點,采用病例-對照研究設(shè)計在中國漢族人群中進(jìn)行再次驗證。病例組來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科住院2型糖尿病患者(n=1118),對照組來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體

3、檢中心的無糖尿病體檢者(n=1161)。
　　研究對象測量身高、體重、腰圍、臀圍、血壓,計算體重指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR),檢測空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等生化指標(biāo),對無糖尿病史個體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)口服葡萄糖耐量試驗。
　　從HapMapPhaseⅡ選擇SLC6A20基因(包括基因上游20kb和下游10kb區(qū)域)符合R2=1和次要等

4、位基因頻率(minorallelefrequency(MAF))＞0.05的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(taggingsinglenucleotidepolymorphism(taggingSNP))位點。采集受試者抗凝血標(biāo)本,鹿特丹隊列研究用鹽析法抽提DNA,用Illumina基因分型芯片(InfiniumⅡHumanHap550KGenotypingBeadChip(R)version3(Illumina,SanDiego,LJSA))進(jìn)行

5、等位基因分型;荷蘭人群病例-對照研究用鹽析法抽提DNA,用TaqMan等位基因分型技術(shù)和基因型填補(bǔ)法(imputation)進(jìn)行等位基因分型:中國人群病例-對照研究用酚-氯仿法抽提DNA,用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行等位基因分型(MassARRAYCompactAnalyzer,Sequenom,SanDiego,CA)。
　　使用卡方檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。偏離Hardy-Weinberg平衡的

6、SNP位點不進(jìn)入下一步分析。用Haplo.Stats進(jìn)行單倍型估計。用Cox比例風(fēng)險模型檢驗隊列研究中各多態(tài)性位點等位基因、基因型或單倍型與2型糖尿病風(fēng)險的關(guān)系。用logistic回歸模型檢驗病例-對照研究中各多態(tài)性位點等位基因、基因型或單倍型與2型糖尿病風(fēng)險的關(guān)系。用多元線性回歸模型檢驗隊列研究中各多態(tài)性位點等位基因或單倍型與總膽固醇,HDL,BMI,腰圍,腰臀比,收縮壓和舒張壓的關(guān)系。用一般線性模型比較各多態(tài)性位點不同基因型之間總膽

7、固醇,HDL,BMI,腰圍,腰臀比,收縮壓和舒張壓的差異。所有模型均校正性別和年齡。附加模型進(jìn)一步校正BMI。用Bonferronicorrection的方法對多重檢驗進(jìn)行校正。
　　結(jié)果:
　　在鹿特丹隊列研究中,共有22個標(biāo)簽SNP的等位基因分型數(shù)據(jù)可以從Illumina550K基因分型芯片檢測數(shù)據(jù)中獲得。19個SNP位點在整個隊列研究人群及非糖尿病人群中均符合Hardy-Weinberg平衡。3個SNP位點-rs677

8、0261,rs2531747和rs12488144偏離Hardy-Weinberg平衡(卡方檢驗P值分別為＜0.001,0.01,0.02),未進(jìn)入下一步研究。7個SNP位點和2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。校正年齡和性別后,rs13062383,rs10461016和rs2286489的次要等位基因增加2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(HR=1.34,95％CI1.13-1.60,p=0.001;HR=1.30,95％CI1.09-1.54,p=0.0

9、03;HR=1.20,95％CI1.07-1.35,p=0.003);rs17279465,rs2191028,rs2191027和rs4299518的次要等位基因降低2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(HR=0.86,95％CI0.76-0.97,p=0.01;HR=0.84,95％C10.74-0.95,P=0.01;HR=0.85,95％CI0.74-0.97,p=0.02;HR=0.86,95％CI0.76-0.97,p=0.02)。進(jìn)一步校

10、正BMI,以上SNP與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險仍相關(guān)。用Bonferronicorrection方法對多重檢驗進(jìn)行校正后,rs13062383,rs10461016和rs2286489與2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān);而rs17279465,rs2191028,rs2191027和rs4299518與2型糖尿病的關(guān)系不再顯著。
　　對SLC6A20基因19個SNP和多個臨床變量的關(guān)系進(jìn)行分析,包括總膽固醇,HDL-C,BMI,腰圍,腰臀

11、比,收縮壓和舒張壓,發(fā)現(xiàn)多個多態(tài)性位點和以上臨床變量有關(guān)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,以上相關(guān)性均不顯著。
　　對SLC6A20基因19個SNP進(jìn)行單倍型區(qū)塊構(gòu)建。19個SNP中有10個SNP分布于4個單倍型區(qū)塊中。校正性別和年齡后,單倍型區(qū)塊1的單倍型H3(GGAC)的2型糖尿病風(fēng)險是單倍型H1(GAAC)的1.24倍(p=0.02)。單倍型區(qū)塊2的單倍型H3(AA)的2型糖尿病風(fēng)險是單倍型H1(AG)的1.28倍(p=0.01)。進(jìn)

12、一步校正BMI,以上單倍型仍和2型糖尿病相關(guān)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,單倍型區(qū)塊2與糖尿病發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān);單倍型區(qū)塊1與糖尿病發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性不再顯著。各單倍型與臨床變量的關(guān)系經(jīng)多重檢驗校正后均不顯著。
　　在荷蘭人群病例.對照研究中,rs13062383和rs10461016在整個人群及非2型糖尿病對照組均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年齡和性別后,rs13062383的A等位基因增加2型糖尿病風(fēng)險(OR=1.45,

13、95％CI1.19-1.76,p=0.000)。進(jìn)一步校正BMI,兩者的相關(guān)性仍然顯著。Rs10461016和2型糖尿病的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)顯著性(OR=0.95,95％CI0.80-1.13,p=0.55)。
　　在中國漢族人群病例.對照研究中,rs13062383在整個人群及非2型糖尿病對照組均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年齡和性別后,rs13062383的A等位基因增加2型糖尿病風(fēng)險(OR=1.21,95％CI1.0

14、3-1.42,p=0.02)。進(jìn)一步校正EBMI,兩者的相關(guān)性更為顯著(OR=1.26,95％CI1.07-1.49,p=0.007)。
　　結(jié)論:
　　SLC6A20基因rsl3062383G/A多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。SLC6A20基因是2型糖尿病的易感基因。
　　第二部分
　　GCKR基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究
　　目的:
　　明確葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(glucokinase

15、regulatoryprotein,GCKR)基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。
　　方法:
　　采用病例-對照研究設(shè)計。糖尿病病例來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科的住院2型糖尿病患者(n=1118);對照組來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢中心的無糖尿病體檢者(n=1161)。
　　所有研究對象均測量身高、體重、腰圍、臀圍、血壓,計算體重指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR),檢測空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)

16、、甘油三酯(TG)、、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等生化指標(biāo),對無糖尿病史個體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)口服葡萄糖耐量試驗。2型糖尿病患者進(jìn)行精氨酸試驗,并計算急性相胰島素分泌(acuteinsulinresponse,AIR)和急性相C肽分泌(acuteC-peptideresponse,ACPR)。
　　從HapMapPhaseⅡ選擇GCKR基因(包括基因上游20kb和下游9kb區(qū)域)符合R2＞0.8和次要

17、等位基因頻率(minorallelefrequency(MAF))＞0.05的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(taggingsinglenucleotidepolymorphism(1aggingSNP))位點。采集受試者抗凝血標(biāo)本,用酚-氯仿法抽提DNA。用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行等位基因分型(MassARRAYCompactAnalyzer,Sequenom,SanDiego,CA)。
　　用卡方檢驗進(jìn)行Hardy-Wein

18、berg平衡檢驗。偏離Hardy-Weinberg平衡的多態(tài)性位點不進(jìn)入下一步分析。用Haplo.Stats進(jìn)行單倍型估計。用logistic回歸模型檢驗各多態(tài)性位點等位基因、基因型及單倍型與2型糖尿病風(fēng)險的關(guān)系。用多元線性回歸模型檢驗各多態(tài)性位點等位基因與BMI,腰圍,收縮壓,舒張壓,空腹血糖,總膽固醇,甘油三酯,HDL-C,LDL-C的關(guān)系。用一般線性模型檢驗各多態(tài)性位點不同基因型之間及單倍型之間BMI,腰圍,收縮壓,舒張壓,空腹血

19、糖,總膽固醇,甘油三酯,HDL-C,LDL-C,AIR和ACPR的差異。所有模型均校正性別和年齡。附加模型進(jìn)一步校正BMI。用Bonferronicorrection的方法對多重檢驗進(jìn)行校正。
　　結(jié)果:
　　rs8179206,rs2293572,rs3817588和rs780094在整個人群及非糖尿病對照組均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年齡和性別后,rs3817588的G等位基因增加2型糖尿病風(fēng)險(OR=1

20、.21,95％CI1.06-1.39,p=0.004);rs780094的G等位基因增加2型糖尿病風(fēng)險(OR=1.19,95％CI1.05-1.34,p=0.005)。進(jìn)一步校正BMI,上述相關(guān)性仍然顯著。Rs8179206和rs2293572與2型糖尿病的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)顯著性(OR=1.18,95％C10.85-1.65,p=0.32:OR=1.04,95％C10.88-1.23,p=0.64)。
　　在對照組,校正性別、年齡和B

21、MI后,rs3817588和rs780094與血甘油三酯水平相關(guān)(p＜0.001,p=0.02)。rs3817588的G等位基因和rs780094的G等位基因均與較低的血甘油三酯水平相關(guān)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,rs3817588與血甘油三酯水平仍然顯著相關(guān),rs780094與血甘油三酯水平的相關(guān)性不再顯著。rs8179206和rs2293572與血甘油三酯水平的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)顯著性。校正性別和年齡后,rs3817588與腰圍相關(guān)(p=0.

22、01)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,兩者的相關(guān)性不再顯著。其余位點與腰圍的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)顯著性。各多態(tài)性位點與BMI,空腹血糖,總膽固醇,HDL-C,LDL-C,收縮壓和舒張壓的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)顯著性。
　　校正年齡,性別和BMI后,rs3817588的G等位基因降低高甘油三酯血癥的發(fā)病風(fēng)險(OR=0.80,95％C10.65-1.00,p=0.05)。然而,對多重檢驗進(jìn)行校正后,兩者的相關(guān)性不再顯著。rs780094等位基因與高甘油三酯血癥

23、的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)顯著性。
　　將2型糖尿病患者按糖尿病病程的四分位數(shù)分組。在第2四分位數(shù)(病程1-7年)組,校正性別,年齡和BMI后,rs8179206的G等位基因與較低的精氨酸刺激的AIR和ACPR相關(guān)(p=0.03,p=0.01)。在第3四分位數(shù)(病程8-11年)組,校正性別,年齡和BMI后,rs780094的G等位基因與較低的精氨酸刺激的AIR相關(guān)(p=0.03)。在第4四分位數(shù)(病程＞11年)組,校正性別,年齡和BMI后,

24、rs3817588的G等位基因與較低的精氨酸刺激的AIR和ACPR相關(guān)(p=0.03,0.03)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,上述相關(guān)性均不再顯著。
　　對GCKR基因4個SNP進(jìn)行單倍型區(qū)塊構(gòu)建。其中2個SNP-rs3817588和rs780094構(gòu)成1個單倍型區(qū)塊。校正性別和年齡后,單倍型區(qū)塊與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)(pfortrend=0.016)。GG單倍型的2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險是AA單倍型的1.24倍(p=0.003)。進(jìn)一

25、步校正BMI,以上單倍型仍和2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)。
　　在對照組,校J下性別,年齡和BMI后,單倍型區(qū)塊與血甘油三酯水平相關(guān)(pfortrend=0.001)。GG單倍型的血甘油三酯水平較AA單倍型低(p＜0.001)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,上述相關(guān)性仍然顯著。校正性別和年齡后,單倍型區(qū)塊與腰圍水平相關(guān)(pfortrend=0.03)。GG單倍型的腰圍水平較AA單倍型高(p=0.01)。對多重檢驗進(jìn)行校正后,上述相關(guān)性不再顯

26、著。BMI,空腹血糖,總膽固醇,HDL-C,LDL-C,收縮壓和舒張壓在各單倍型之間無顯著差異。
　　校正性別,年齡和BMI后,單倍型區(qū)塊與高甘油三酯血癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)顯著性(pfortrend=0.69)。
　　在各糖尿病病程四分位組,校正性別,年齡和BMI后,單倍型區(qū)塊與精氨酸刺激的AIR及ACPR的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)顯著性。
　　結(jié)論:
　　GCKR基因rs780094A/G多態(tài)性和rs3817588